Enzymologie Flashcards
Kcat (min) =(c)catalytique ou activité moléculaire spé
=Vmax/(E)tot ou =ASxMM ou = 1/tps de rétention
notion de vitesse initiale pendant la phase stationnaire
Vo= dP/dt ou dS/dt
inhibition compétitive, calcule Voapp
l’inhibiteur et le substrat se fixe sur le même site, réversible, l’inhibition peut être levée par excès de S
KM>KMapp : perte d’affinité pour le substrat
VM=VMapp
Voapp=VM x (S)/(S)+KMapp
avec KMapp=KMx(1+ (I)/Ki )
Inhibition non compétitive
l’inhibiteur se lie aussi bien à l’enzyme libre qu’au complexe ES
liaison sur des sites différents
KM=KMapp
VM>VMapp
Voapp=VMapp x (S)/(S)+KM
avec VMapp=VM/(1+(I)/Ki)
inhibition incompétitive
il se fixe seulement au complexe E-S mais pas à l’enzyme libre = fixation séquentielle = la fixation empêche la catalyse enzymatique
KM>KMapp
VM>VMapp
Voapp=VMapp x (S)/ (S) + KMapp
avec KMapp=KM / 1+(I)/Ki
ou VMapp=VM/ 1+(I)/Ki
degré d’inhibition incompétitive
aug quand S aug
%=(I)/ ((I)+Ki x (1 + KM/S))
degré d’inhibition compétitive
dim quand S aug = non linéaire
(I)/ ((I)+Ki x (1+ S/KM))
Représentation de Lineweaver Burk
1/Vo = f(1/(S))
1/Vo =KM/Vmax x 1/(S) + 1/Vmax
Rendement
(Ccap x Vap)/ (Ccav x Vav) x100
Activité spécifique
Cc(U.L)/Cp(g.L)
Facteur d’enrichissement
ASap/ASav
La cinétique d’ordre 1
peut être décrite par une équation de droite
y=ax + b
y=vitesse
a=pente
x=(S)
b=intersection sur l’axe y
La cinétique d’ordre 0
région du plateau
ne peut pas être décrire par y=ax+b
donc recours à l’equat° de M-M
=>la (c) en E est très faible = (ES) est très faible devant la (S) : (ES)«(S)
Equation de M-M
Vo=Vmax x (S)/(S)+KM
Hypothèse de l’état quasi-stationnaire: (ES) reste constante pdt la réaction enzym
et Vitesse de formation de ES= Vitesse de dissociation de ES
Vo=Kcat(ES)
-Si (S)»_space; KM : on peut négliger KM : on a Vo = Vmax(S)/(S) donc Vo=Vmax
Quelles sont les conditions de vitesse initiale et quel est son intérêt principal?
Conditions de vitesse initiale = conditions conventionnelles
Travail en début de réaction : cinétique d’ordre 0 (linéaire),
=La vitesse de formation du produit est constante et indépendante des concentration en réactifs.
Objectif : Obtenir une cinétique linéaire
Fixer tous les autres paramètres de la réaction :
- pH et température optimaux de l’enzyme
- Force ionique
- Nature et concentration du tampon
- Nature et concentration en effecteurs
L’équation de Michaelis-Menten (vo=Vm+(S)/KM+(S))
ne s’applique qu’en condition de vitesse initiale= condition de l’état stationnaire
→ La vitesse initiale correspond/ Mesure de Vo par détermination de la tangente à l’origine de la pente de la courbe [P]=f(t)
càd la dérivée de la courbe lorsque t tend vers 0
Quelles sont les conditions de cinétique à respecter pour valider les mesures à partir de la réaction décrite ?
Quelles sont les conditions à respecter vis-à-vis de la concentration en créatinine, théorique et pratique, exprimée en unité Km ?
On cherche à remplir les conditions d’application de l’équation de Michaelis Menten, soit :
- travailler en conditions de vitesse initiale
- respecter une cinétique linéaire (valable uniquement en début de réaction) càd d’ordre 1 par rapport au substrat à doser, ici la créatinine
- nécessaire de fixer tous les autres paramètres réactionnels:
→ T°C et pH optimaux de l’enzyme (si incompatibilités entre protéines, procéder par étapes successives)
→ force ionique
→ nature et concentration du tampon
→ nature et concentration des effecteurs (coenzymes)
La concentration en créatinine :
- doit être le facteur limitant de la réaction
- pour permettre une cinétique d’ordre 1 vis-à-vis de la créatinine amidohydrolase
- de sorte que la vitesse initiale V0 ne dépende que de la concentration en analyte
En théorie :
- la concentration en substrat [S] doit être largement inférieure à la cte de Michaelis
- on note [S] «_space;KM
En pratique :
- la concentration en substrat [S] est inférieure au dixième de la cte de Michaelis
- on note [S] < 0,1.KM
Quant aux concentrations de tous les réactifs autres que le substrat à doser, elles sont déterminées :
- afin de respecter des cinétiques d’ordre 0 vis-à-vis de leurs enzymes respectives
- càd en large excès / saturantes / non limitantes
En théorie : [S]»_space; KM
En pratique : [S] > 10.KM
Quelles sont les conditions de vitesse initiale et quel est son intérêt principal ?
Conditions de vitesse initiale = conditions conventionnelles
Travail en début de réaction : cinétique d’ordre 0 (linéaire), càd que la vitesse de formation du produit est constante et indépendante des concentration en réactifs
Fixer tous les autres paramètres de la réaction :…
Intérêt : cinétique linéaire facilement interprétable, pas de calcul de dérivée nécessaire
Pour quelle raison la représentation de Lineweaver-Burk est-elle plébiscitée au quotidien ?
La représentation graphique en double inverse dite de Lineweaver et Burk permet
- une régression linéaire de l’équation de Michaelis Menten, facile à réaliser et à lire
- d’améliorer la précision de la détermination des paramètres enzymatiques par
lecture graphique
Pourcentage de sites actifs occupés (SAO) par le substrat
𝑆𝐴𝑂= 𝑉0/𝑉𝑚𝑎𝑥
= (𝑉 ·[𝑆])/𝐾𝑚+[𝑆])/𝑉𝑚𝑎𝑥 = (𝑉𝑚𝑎𝑥·[𝑆]/𝐾𝑚 + [𝑆]) · 1/𝑉𝑚𝑎𝑥
= [𝑆]/𝐾𝑚 + [𝑆] =
0,1.𝐾𝑚/𝐾𝑚+0,1.𝐾𝑚 = 0,1/1,1 =0,091soit9,1%
Préciser les conditions (théorique et pratique) à respecter
pour que la vitesse soit d’ordre 1 par rapport à la concentration en substrat S.
cinétique linéaire (valable uniquement en début de réaction) = ordre 1 par rapport au substrat à doser
- nécessaire de fixer tous les autres paramètres réactionnels:
→ T°C et pH optimaux de l’enzyme (si incompatibilités entre protéines, procéder par étapes successives)
→ force ionique
→ nature et concentration du tampon
→ nature et concentration des effecteurs (coenzymes)
Condition théorique : [S] «_space;Km.
Condition pratique : [S] < 0,1Km
% pureté
% = (E)T/(protéines)
avec (E)T= Vm/Kcat (mol/L)
attention aux unités !
1KDa= 1g/mol
→ (E)T x ?Da= (E)T en g/mol
puis application de la formule
