Enzymologie

Question 1

Kcat (min) =(c)catalytique ou activité moléculaire spé

Answer 1

=Vmax/(E)tot ou =ASxMM ou = 1/tps de rétention

Question 2

notion de vitesse initiale pendant la phase stationnaire

Answer 2

Vo= dP/dt ou dS/dt

Question 3

inhibition compétitive, calcule Voapp

Answer 3

l’inhibiteur et le substrat se fixe sur le même site, réversible, l’inhibition peut être levée par excès de S
KM>KMapp : perte d’affinité pour le substrat
VM=VMapp
Voapp=VM x (S)/(S)+KMapp
avec KMapp=KMx(1+ (I)/Ki )

Question 4

Inhibition non compétitive

Answer 4

l’inhibiteur se lie aussi bien à l’enzyme libre qu’au complexe ES
liaison sur des sites différents
KM=KMapp
VM>VMapp
Voapp=VMapp x (S)/(S)+KM
avec VMapp=VM/(1+(I)/Ki)

Question 5

inhibition incompétitive

Answer 5

il se fixe seulement au complexe E-S mais pas à l’enzyme libre = fixation séquentielle = la fixation empêche la catalyse enzymatique
KM>KMapp
VM>VMapp
Voapp=VMapp x (S)/ (S) + KMapp
avec KMapp=KM / 1+(I)/Ki
ou VMapp=VM/ 1+(I)/Ki

Question 6

degré d’inhibition incompétitive

Answer 6

aug quand S aug
%=(I)/ ((I)+Ki x (1 + KM/S))

Question 7

degré d’inhibition compétitive

Answer 7

dim quand S aug = non linéaire
(I)/ ((I)+Ki x (1+ S/KM))

Question 8

Représentation de Lineweaver Burk

Answer 8

1/Vo = f(1/(S))
1/Vo =KM/Vmax x 1/(S) + 1/Vmax

Question 9

Rendement

Answer 9

(Ccap x Vap)/ (Ccav x Vav) x100

Question 10

Activité spécifique

Answer 10

Cc(U.L)/Cp(g.L)

Question 11

Facteur d’enrichissement

Answer 11

ASap/ASav

Question 12

La cinétique d’ordre 1

Answer 12

peut être décrite par une équation de droite
y=ax + b
y=vitesse
a=pente
x=(S)
b=intersection sur l’axe y

Question 13

La cinétique d’ordre 0

Answer 13

région du plateau
ne peut pas être décrire par y=ax+b
donc recours à l’equat° de M-M
=>la (c) en E est très faible = (ES) est très faible devant la (S) : (ES)«(S)

Question 14

Equation de M-M

Answer 14

Vo=Vmax x (S)/(S)+KM

Hypothèse de l’état quasi-stationnaire: (ES) reste constante pdt la réaction enzym
et Vitesse de formation de ES= Vitesse de dissociation de ES

Vo=Kcat(ES)

-Si (S)&raquo_space; KM : on peut négliger KM : on a Vo = Vmax(S)/(S) donc Vo=Vmax

Question 15

Quelles sont les conditions de vitesse initiale et quel est son intérêt principal?

Answer 15

Conditions de vitesse initiale = conditions conventionnelles
Travail en début de réaction : cinétique d’ordre 0 (linéaire),
=La vitesse de formation du produit est constante et indépendante des concentration en réactifs.
Objectif : Obtenir une cinétique linéaire ​

Fixer tous les autres paramètres de la réaction :
- pH et température optimaux de l’enzyme
- Force ionique
- Nature et concentration du tampon
- Nature et concentration en effecteurs

L’équation de Michaelis-Menten (vo=Vm+(S)/KM+(S))
ne s’applique qu’en condition de vitesse initiale= condition de l’état stationnaire
→ La vitesse initiale correspond/ Mesure de Vo par détermination de la tangente à l’origine de la pente de la courbe [P]=f(t)
càd la dérivée de la courbe lorsque t tend vers 0

Question 16

Quelles sont les conditions de cinétique à respecter pour valider les mesures à partir de la réaction décrite ?
Quelles sont les conditions à respecter vis-à-vis de la concentration en créatinine, théorique et pratique, exprimée en unité Km ?

Answer 16

On cherche à remplir les conditions d’application de l’équation de Michaelis Menten, soit :
- travailler en conditions de vitesse initiale
- respecter une cinétique linéaire (valable uniquement en début de réaction) càd d’ordre 1 par rapport au substrat à doser, ici la créatinine
- nécessaire de fixer tous les autres paramètres réactionnels:
→ T°C et pH optimaux de l’enzyme (si incompatibilités entre protéines, procéder par étapes successives)
→ force ionique
→ nature et concentration du tampon
→ nature et concentration des effecteurs (coenzymes)

La concentration en créatinine :
- doit être le facteur limitant de la réaction
- pour permettre une cinétique d’ordre 1 vis-à-vis de la créatinine amidohydrolase
- de sorte que la vitesse initiale V0 ne dépende que de la concentration en analyte

En théorie :
- la concentration en substrat [S] doit être largement inférieure à la cte de Michaelis
- on note [S] &laquo_space;KM
En pratique :
- la concentration en substrat [S] est inférieure au dixième de la cte de Michaelis
- on note [S] < 0,1.KM

Quant aux concentrations de tous les réactifs autres que le substrat à doser, elles sont déterminées :
- afin de respecter des cinétiques d’ordre 0 vis-à-vis de leurs enzymes respectives
- càd en large excès / saturantes / non limitantes
En théorie : [S]&raquo_space; KM
En pratique : [S] > 10.KM

Question 17

Quelles sont les conditions de vitesse initiale et quel est son intérêt principal ?

Answer 17

Conditions de vitesse initiale = conditions conventionnelles
Travail en début de réaction : cinétique d’ordre 0 (linéaire), càd que la vitesse de formation du produit est constante et indépendante des concentration en réactifs

Fixer tous les autres paramètres de la réaction :…

Intérêt : cinétique linéaire facilement interprétable, pas de calcul de dérivée nécessaire

Question 18

Pour quelle raison la représentation de Lineweaver-Burk est-elle plébiscitée au quotidien ?

Answer 18

La représentation graphique en double inverse dite de Lineweaver et Burk permet
- une régression linéaire de l’équation de Michaelis Menten, facile à réaliser et à lire
- d’améliorer la précision de la détermination des paramètres enzymatiques par
lecture graphique

Question 19

Pourcentage de sites actifs occupés (SAO) par le substrat

Answer 19

𝑆𝐴𝑂= 𝑉0/𝑉𝑚𝑎𝑥
= (𝑉 ·[𝑆])/𝐾𝑚+[𝑆])/𝑉𝑚𝑎𝑥 = (𝑉𝑚𝑎𝑥·[𝑆]/𝐾𝑚 + [𝑆]) · 1/𝑉𝑚𝑎𝑥
= [𝑆]/𝐾𝑚 + [𝑆] =
0,1.𝐾𝑚/𝐾𝑚+0,1.𝐾𝑚 = 0,1/1,1 =0,091soit9,1%

Question 20

Préciser les conditions (théorique et pratique) à respecter
pour que la vitesse soit d’ordre 1 par rapport à la concentration en substrat S.

Answer 20

cinétique linéaire (valable uniquement en début de réaction) = ordre 1 par rapport au substrat à doser
- nécessaire de fixer tous les autres paramètres réactionnels:
→ T°C et pH optimaux de l’enzyme (si incompatibilités entre protéines, procéder par étapes successives)
→ force ionique
→ nature et concentration du tampon
→ nature et concentration des effecteurs (coenzymes)

Condition théorique : [S] &laquo_space;Km.
Condition pratique : [S] < 0,1Km

Question 21

% pureté

Answer 21

% = (E)T/(protéines)

avec (E)T= Vm/Kcat (mol/L)
attention aux unités !

1KDa= 1g/mol
→ (E)T x ?Da= (E)T en g/mol

puis application de la formule