Enzyme

Question 1

Wie unterscheiden sich die Typen der Inhibition kinetisch ?

Answer 1

Kompetitive Inhibition kann durch große Mengen an Substrat unwirksam gemacht werden. Jedoch ist der apparente KM – Wert erhöht. Bei der nichtkompetitiven Inhibierung kann Substrat an den EI Komplex binden, jedoch ist Vmax vermindert. Bei der gemischten Inhibierung können beide Werte abweichen.

Question 2

Was ist die Obergrenze von k_cat / K_M ?

Answer 2

Die Diffusionskontrollierte Interaktion von Substrat und Enzym bestimmt die Obergrenze der Rate. Diese liegt bei

10⁸ – 10⁹ s^-1M^-1.

Question 3

Folgen allosterische Enzyme der traditionellen Michaelis-Menten-Kinetik? Zeichnen Sie ein Diagramm der Reaktionsrate relativ zur Substratkonzentration für ATCase und vergleichen Sie es mit dem Diagramm eines Michaelis-Menten Enzyms.

Answer 3

Nein, ATCase zeigt eine unterschiedliche Kinetik. Eine graphische Darstellung der Geschwindigkeit gegen Substratkonzentration zeigt eine sigmoidale Kurve, entgegengesetzt der einfachen hyperbolischen Kurve eines Enzyms das der Michaelis-Menten-Kinetik folgt.

Question 4

Du denkst, ein Substrat passt in die Bindungsstelle wie ein Schlüssel ins Schlüsselloch… Dein Kumpel ist da anderer Meinung, wer hat Recht ?

Answer 4

Beide haben bedingt Recht. Generell passt ein Substrat präzise in die Bindungsstelle wie ein Schlüssel ins Schlüsselloch. Allerdings ist die Bindungsstelle eines Enzyms nicht zwangsweise ein starres Konstrukt, sondern kann durchaus flexibel sein. So kann ein Substrat auch die Form der Bindungsstelle ein bisschen anpassen, eine Hypothese die als„Induced Fit“ bekannt ist.

Question 5

Bedeutung von K_M ?

Answer 5

Maß für die Stabilität des ESK

hoher Wert: schwache, niedrige Bindung

niedriger Wert: starke Bindung

(Es können immer mehrere Substrate im AZ binden, aber nur das richtige Substrat kann die maximale Bindungsenergie erreichen)

Question 6

Beschreibe die Michaelis-Menten Gleichung ! Definiere alle Parameter !

Answer 6

v₀ = v_max • (S / (S + K_M))

Anfangsgeschwindigkeit: v₀

Maximalgeschwindigkeit: v_max

Substratkonzentration: S
Michaelis Konstante: K_M

Question 7

Die Sequenz der 6 basenpaarlangen Restriktionsschnittstelle von EcoRV ist GATXXX. Wie lautet die komplette Sequenz der Erkennungsstelle?

Answer 7

GATATC

CTATAG

Question 8

Wie können kovalente Modifikationen genutzt werden um den Mechanismus eines Enzyms zu untersuchen?

Answer 8

Wenn für eine bestimmte Aminosäure angenommen wird, dass diese am Mechanismus beteiligt ist, führt eine kovalente Modifikation des Restes zu einer Änderung der Enzymaktivität. Jedoch, muss diese Methode gewöhnlich durch andere Techniken bestätigt werden (Bsp. ortsgerichtete Mutagenese, Zirkluardichroismus, …) um auszuschließen, dass der Verlust der Aktivität beispielsweise durch konformationelle Änderungen verursacht wird.

Question 9

Wie wird die Kinase-Kaskade aktiviert?

Answer 9

Der Prozess wird oft durch Hormone, die an Membran-Rezeptoren binden eingeleitet. Dieser Prozess aktiviert die Adenylat Cylase, die die Bildung von cAMP, einem intrazellulären Botenstoff bewirkt. Das cAMP aktiviert eine wichtige Protein-Kinase. In eukaryotischen Zellen ist dies ein allosterisches Enzym, die Protein-Kinase A, die dann verschiedenen Zielproteine phosphoryliert.

Question 10

Medikamentenentwicklung zur Inhibierung von Enzymen ist ein wichtiger Bereich der pharmazeutischen Forschung. Welche Enzymeigenschaften sind in diesem Zusammenhang interessant?

Answer 10

Enzyme können durch Wechselwirkungen mit einem potentiellen Wirkstoff, welcher entweder im aktiven Zentrum oder in einer regulatorischen Stelle bindet, inhibiert werden. Die Struktur von natürlichen Substraten und Aktivatoren und deren Bindungsstellen sind nützliche Angriffstelle für die Entwicklung neuer Medikamente. Dabei ist die Bindungsaffinität und Spezifität wichtig. Mit Enzymaktivitätstest kann der Einfluss der Inhibitoren auf kcat-, KM-, und Vmax-Werte bestimmt werden.

Question 11

Wie werden Substrate im aktiven Zentrum gebunden ?

Answer 11

Das aktive Zentrum ist ein kleiner Teil des Enzyms, bei dem meist ein dreidimensionaler Hohlraum durch Aminosäuren unterschiedlicher Regionen und Polypeptidketten gebildet wurde. Das Substrat wird hier durch zahlreiche nicht-kovalente Wechselwirkungen wie z.B. elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van der Waals Kräfte und hydrophobe Wechselwirkungen gebunden. Die Spezifität des Enzyms für ein Substrat hängt dabei von der präzisen Anordnung der funktionellen Gruppen innerhalb der Bindungsstelle ab.

Question 12

Worin liegt die Ursache für den „burst“ der Aktivität und die folgende steady-state-Reaktion von Chymotrypsin wenn man den Reaktionsverlauf mit Hilfe eines stopped- flow Spektrophotometer verfolgt?

Answer 12

Chymotrypsin spaltet Peptidbindungen in einer Zweischrittreaktion. Dabei ist der erste Schritt (Bildung des Acyl-Enzym-Intermediates) schneller ist als der zweite Schritt (Hydrolyse).

Question 13

In vielen Enzym-Tests werden nicht die natürlichen Substrate und Produkte eingesetzt. Warum ?

Answer 13

Viele Produkte sind schwer nachzuweisen. Einige lassen sich nur schlecht messen, wohingegen andere schwer von den restlichen Substanzen der Reaktion zu unterscheiden sind. Daher werden gerne Substrate verwendet, die noch vom Enzym umgesetzt werden, jedoch leicht messbare Produkte liefern. Beispielsweise finden häufig Substrate Verwendung, die farbige Produkte liefern, die dann photometrisch detektiert werden können.

Question 14

Was ist das Nukleophil von Cystein-, Metallo- und Aspartatproteasen?

Answer 14

Das Nukleophil ist Wasser.

Question 15

Wie wird die Blutgerinnungskaskade initiiert?

Answer 15

Sowohl intrinsische (beschädigte Oberfläche) und extrinsische (Trauma) Auslöser können die Kaskade induzieren. Die ersten Schritte unterscheiden sich hierbei, führen aber letztlich zu einem abschließenden, gemeinsamen Weg, um die Fibringerinnsel zu bilden.

Question 16

Was ist die allgemeine Strategie von Cystein-, Metallo- und Aspartatproteasen?

Answer 16

Alle nutzen einen Mechanismus bei dem ein Nukleophil gebildet wird, welches dann die Carbonylfunktion der Peptidbindung angreift.

Question 17

Welches Merkmal von Carboanhydrase erlaubt die schnelle Hydratatisierung von Kohlendioxid?

Answer 17

Die räumliche Annäherung der beiden Reaktanten (Kohlendioxid und Wasser) und die Gegenwart eines Puffersystems welches die Protonentransferreaktionen unterstützt.

Question 18

Wie unterscheidet sich das sequentielle Modell von dem symetrischen Modell für allosterische Enzyme?

Answer 18

Das symetrische Modell erlaubt nichts anderes als eine “Alles-oder-Nichts”- Form des Proteins (komplett gespannt oder entspannt). Im Gegensatz dazu ermöglicht das sequentielle Modell eine gemischte Art des Proteins, mit einigen gespannten und entspannten Untereinheiten. Die Form ist abhängig von der Ligandenbindung an eine bestimmte Untereinheit.

Question 19

Wie unterscheiden sich die Zwischenstufen bei Enzymmechanismen mit mehreren Substraten ?

Answer 19

Bei einem sequentiellen Mechanismus binden beide Substrate und bilden einen ternären Komplex aus. Bei einem Ping-Pong Mechanismus werden ein oder mehrere Produkte freigesetzt bevor alle Substrate gebunden sind. Somit werden hier ausgetauschte Enzymintermediate gebildet.

Question 20

Was unterstützt die Theorie, dass die katalytische Triade ein effektives Mittel ist um die Hydrolyse von Peptide zu bewerkstelligen?

Answer 20

Zahlreiche verschiedene Enzyme unter ihnen die Peptidasen und einige Esterasen nutzen ähnliche Reaktionsmechanismen. Während die Strategie dieselbe ist, sind die darin beteiligten Aminosäurereste verschieden. Dies führt zu den Schluss, dass dieser häufig zum Einsatz kommende Mechanismus das Ergebnis von konvergente Evolution ist.

Question 21

Warum werden Substratanaloge eingesetzt um die Aktivität von Enzymen zu messen?

Answer 21

Ein Enzymaktivitätstest muss so gestaltet sein, dass der Verbrauch des Substrates bzw. die Bildung des Produktes schnell und einfach gemessen werden kann. Substrate die bei der Umsetzung ihre spektralen Eigenschaften ändern, können somit leicht mit Hilfe eines Spektrophotometers quantifiziert werden.

Question 22

Nennen Sie ein Beispiel, beidem beide Substrate vor der Katalyse gebunden werden.

Answer 22

Z.B. Laktatdehydrogenase und Kreatinkinase.

Question 23

Warum war es überraschend, dass CTP ATCase hemmt?

Answer 23

Die Substrate für ATCase sind Carbamoylphosphat und Aspartat. Diese Moleküle ähneln nicht CTP. Somit war es klar, dass CTP nicht an der aktiven Stelle, aber dafür an einer anderen regulatorischen Stelle binden muss.

Question 24

Welchen Mechanismus nutzen Restriktionsendonukleasen um DNA zu spalten?

Answer 24

Ein aktiviertes Wassermolekül greift direkt das Phosphoratom der Phospodiesterbindung an.

Question 25

Warum ist eine kovalente Modifikation im Vergleich zur proteolytische Aktivierung von Vorteil?

Answer 25

Kovalente Modifikation sind in der Regel ein reversibler Prozess.

Question 26

Was ist der letzte Schritt im Blutgerinnungweg?

Answer 26

Im letzten Schritt wird Fibrinogen, welches sechs Ketten aus drei Typen Untereinheiten- enthält, verändert. Thrombin spaltet vier der Ketten, was zur Bildung von Fibrinmonomeren führt. Diese Monomere bilden spontan das Fibrinnetz. Das Gerinnsel wird durch Querverbindungen zwischen den Aminosäuren katalysiert durch Transglutaminase stabilisiert.

Question 27

Denken Sie dass die Reihenfolge der Substratbindung eine wichtige Rolle für die Enzymkatalyse spielt?

Answer 27

In manchen Fällen, ja. Bei Ping-Pong Mechansimen beispielsweise muss das richtige Substrat binden um das korrekte Enzymintermediat zu bilden. Bei sequentiellen Mechanismen kommen sowohl geordnete Substratbindung (z.B. Laktatdehydrogenase), als auch ungeordnete Substratbindung und Produktfreisetzung vor (Kreatin Kinase).

Question 28

Geben Sie mehrere Beispiele für Enzyme und Proteine, die durch proteolytische Aktivierung aktiviert werden.

Answer 28

Beispiele sind Verdauungsenzyme (Trypsin), Hormone (Insulin), Gerinnungsenzyme (Fibrinogen), Entwicklungsprozess Proteinen (Kollagen) und Apoptose-Proteine (Caspasen).

Question 29

Bei einer enzymatischen Reaktion im Reaktionsgefäß kann es zur Einstellung eines Reaktionsgleichgewichts kommen. Wieso passiert das nicht in lebenden Organismen?

Answer 29

In der Zelle werden die Reaktionsprodukte in Folgereaktionen umgesetzt, daher erreicht die Reaktion hier kein Gleichgewicht.

Question 30

Geben Sie ein Beispiel für eine durch eine Hydrolase katalysierte Reaktion !

Answer 30

Hydrolasen katalysieren eine Reaktion, bei der ein Wassermolekül an einer Verbindungsstelle addiert wird, die ursprünglich durch das Entfernen eines Wassermoleküls entstanden ist. Beispiele hierfür sind Ester, Peptidbindungen, glykosidische Bindungen….

Question 31

Was ist die Funktion der Aspartattranscarbamoylase?

Answer 31

Das Enzym katalysiert den ersten Schritt in der Synthese von Pyrimidinen. Es kondensiert Carbamoylphosphat und Aspartat zu N-Carbamoylaspartat und anorganischem Phosphat zu bilden.

Question 32

Was sind Übergangszustandsanaloga ?

Answer 32

Diese sehr wirksamen Inhibitoren ahmen die Struktur eines Übergangszustandes im katalytischen Prozess nach. Sie binden sehr fest an das aktive Zentrum und sind nützlich bei der Aufklärung der Enzymstruktur und des Reaktionsmechansimus.

Question 33

Vervollständigen Sie die katalytische Triade von Chymotrypsin indem sie die richtige Struktur des fehlenden Aminosäurerestes in den dafür vorgesehenen Rahmen einfügen. Zeichnen Sie außerdem die passenden Wasserstoffbrücken ein die in der katalytischen Triade beteiligt sind.

Answer 33

Question 34

Was ist ein Affinitätslabel ?

Answer 34

Hierunter versteht man ein Substratanalogon, das strukturell dem Substrat sehr ähnlich ist, an das aktive Zentrum des Enzyms bindet und chemisch mit einem Rest des aktiven Zentrums reagiert. Es wird dazu verwendet, die Enzymstruktur und den Reaktionsmechanismus zu erforschen.

Question 35

Warum sind P-Loop Domänen und Mechanismen weit verbreitet?

Answer 35

Diese Strukturen sind in der Lage nach Bindung eines NTP große konformationelle Änderungen durchzuführen und NTP zu hydrolysieren. Diese strukturelle Vielfältigkeit erlaubt eine breite Spezifität.

Question 36

Was ist die zweifache Wirkung von Thrombin?

Answer 36

Zum einen katalysiert Thrombin die Hydrolyse von Fibrinogen um aktives Fibrin zu bilden. Zum anderen spielt es auch eine Rolle beim Herunterfahren der Kaskade durch Regulation von Protein C, einer Protease, die die Gerinnungsenzyme Va und VIIIa verdaut.

Question 37

Was ist die Herausforderung für eine Protease bei der Hydrolyse einer Peptidbindung?

Answer 37

Die Carboxylfunktion der Peptidbindung ist nicht sehr reaktiv. Die Protease muss diese Funktion aktivieren um den nukleophilen Angriff von Wasser zu unterstützen.

Question 38

Phosphorylierung ist ein äußerst wirksames Instrument für die katalytische Steuerung. Erklären Sie die Gründe.

Answer 38

Eine Phosphorylgruppe fügt negativen Ladungen hinzu, so dass neue elektrostatische Wechselwirkungen und neue Wasserstoff-Bindung entstehen können. Die freiwerdende Energie bei der Phosphorylierung ist groß, wodurch sich das konformelle Gleichgewicht der verschiedenen Zustände beeinflusst werden kann. Die Verwendung von ATP bedeutet, dass die Reaktion mit dem Energie-Status der Zelle verknüpft ist. Phosphorylierung ist schnell, umkehrbar und kann zu verstärkenden Wirkungen führen. Diese Faktoren beeinflussen strukturelle, thermodynamische, regulatorischen und kinetischen Eigenschaften.

Question 39

Bedeutung von k_kat/K_M ?

Answer 39

• ein Maß für die katalyt. Effizienz
• Kriterium für Spezifität une Effektivität, denn umso größer k_kat/K_M desto besser ist das Enzym zur Umsetzung des Substrats geeignet
• Maximalwert zw. 10⁸ und 10⁹ M^-1s^-1
• “scheinbare Geschwindigkeitskonstante”, welche die Umwandlung von freiem Substrat und freiem Enzym zum Produkt beschreibt, ohne Zwischenprodukt zu berücksichtigen

Question 40

Was bedeutet v_max ?

Answer 40

Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit oder Rate der Reaktion bei einer gewissen Enzymmenge, gesättigt mit Substrat.

Question 41

Warum sind Metallionen für die Aktivität der meisten NTP-abhängigen Enzyme notwendig?

Answer 41

Diese Enzyme binden nicht NTP, sondern den Metallionen-NTP-Komplex.

Question 42

Bedeutung von k_kat?

Answer 42

entspricht der Anzahl von Substratmolekülen, die bei vollständiger Sättigung pro Zeiteinheit in das Produkt umgewandelt wird

Question 43

Wie wird in der Gegenwart von Carboanhydrase Bicarbonat gebildet?

Answer 43

Ein Zinkion unterstützt die Bildung eines Hydroxidions, welches Kohlendioxid angreifen kann.