Emission moléculaire ou fluorescence/Spectrométrie atomique Flashcards
L’émission d’énergie se fait de l’état fondamental à l’état excité et à toutes les transitions énergétiques
permises, vrai ou faux ?
Faux : L’émission énergétique qui est un transfert de photons, les fait passer de l’état excité à l’état
fondamental, en plus elle concerne seulement les niveaux d’énergie concernés et non toutes les
transitions énergétiques.
SEULES CERTAINES TRANSITIONS SONT PERMISES !
La transition énergétique est associée à une longueur d’onde, vrai ou faux ?
Vrai : E = hc/ λ
Les échanges d’électrons entraînent la destruction des analytes, vrai ou faux ?
Faux : Les électrons passent sur un niveau d’énergie excité et redescendent à l’état fondamental donc
ils ne sont pas détruits.
L’absorption est fonction du solvant et des chromophores, vrai ou faux ?
Vrai : Un chromophore est un groupement chimique responsable de l’absorption donc c’est vrai pour les
chromophores. C’est également vrai pour le solvant car en fonction des interactions entres d’autres
molécules et le solvant, le diagramme énergétique varie légèrement, les longueurs d’ondes peuvent un
peu bouger (effets bathochrome/isochrone/hyperchrome/hypochrome).
Une méthode analytique basée sur l’absorption est une méthode qualitative, vrai ou faux ?
Faux : C’est une méthode quantitative. On étudie des concentrations donc des quantités contrairement
aux méthodes qualitatives qui ont pour fonction l’identification.
Avant toute émission énergétique (flèches bleues), il faut qu’il y ait une
absorption (état fondamental état excité) (flèches oranges)
Les échanges d’électrons sont réversibles, vrai ou faux ?
Faux: ils redescendent à leur état fondamental
Le retour à l’EF (état fondamental) peut se faire :
- Sans rayonnements c’est la relaxation non rayonnante
- Sous forme de chaleur
- Par choc avec d’autres molécules
- Avec rayonnement électromagnétique : c’est le phénomène d’émission, qui peut s’accompagner de chaleur
L’émission a lieu uniquement lorsque l’absorption a été faite, vrai ou faux ?
C’est vrai.
Les électrons subissent une excitation et
lorsque la molécule revient à l’EF (elle revient toujours à l’EF = état fondamental)
Les électrons subissent une excitation et
lorsque la molécule revient à l’EF (elle revient toujours à l’EF = état fondamental). Il y a 2 façons :
- Relaxation vibrationnelle non rayonnante (+ courant) on redescend sur le niveau fondamental sans
émettre de rayonnement => perte d’énergie qui se fait généralement par collision. - Relaxation rayonnante entre 2 états d’énergie => c’est le phénomène d’émission, qui peut
s’accompagner de chaleur. Il permet de faire des analyses quantitatives (l’intensité du rayonnement est
proportionnel à la concentration de l’analyte étudié) et qualitatives (un rayonnement est spécifique d’une
molécule) - Sous forme de chaleur
- Par choc avec d’autres molécules (+ courant) On observe la relaxation rayonnante seulement si elle a
une durée qui est inférieure à la relaxation non rayonnante. On observe toujours le phénomène le plus
court.
Qu’est-ce que la photométrie d’émission ?
Définition : La photométrie d’émission mesure l’émission d’un rayonnement électromagnétique UV ou
visible due à la désexcitation d’atomes qui ont été excités par l’énergie apportée par le transfert à une
température (très) élevée (introduction de l’échantillon dans une flamme ou un plasma) ou par faisceau
lumineux ou rayonnement électromagnétique. L’émission moléculaire équivaut à de la fluorescence.
L’émission c’est le retour à l’état excité vrai ou faux ?
C’est faux, c’est le retour à l’état fondamental par rayonnement électromagnétique.
Que se passe-t-il quand on passe entre 2 niveaux électroniques ?
Il y a une raie de résonance (entre E0 et E1) et ces raies correspondent à la longueur d’onde d’excitation.
C’est le transfert entre deux états électroniques et en particulier entre l’état électronique de premier état
excité et l’état fondamental.
Comme on avait vu que pour l’absorbance pouvait avoir lieu entre plusieurs niveaux, car on passe d’un
état électronique à des états vibrationnels, et donc pour le retour à l’état fondamental c’est pareil on peut
repasser sur des états vibrationnels.
Si l’on passe d’un état triplet à un état singulet, il y aura….
Phosphorescence et le phénomène sera long (qq ms). On va donc avoir une série d’émission de raies qui vont se caractériser sur le spectre par un spectre de
bande.
L’énergie émise est toujours plus grande que l’énergie absorbée, vrai ou faux ?
C’est faux, elle est toujours plus faible que l’énergie absorbée. Donc la longueur d’onde émise sera supérieure à la longueur d’onde d’excitation.
Quelle est la valeur de la longueur d’onde (environ) des UV ?
200-400 nm
Quelle est la valeur de la longueur d’onde (environ) du visible ?
400-900 nm
Comment s’appelle la différence entre la longueur d’onde d’excitation et la longueur d’onde d’émission ?
Δλ s’appelle le
déplacement de stokes.
L’émission ne se fait que sur certaines transitions. On peut avoir plusieurs longueurs d’onde d’excitation
possible qui donneront la même longueur d’onde d’émission. Les énergies ne sont pas toujours
tellement différentes entre les longueurs d’onde donc on peut avoir un même effet avec plusieurs d’onde
d’excitations différentes, mais l’émission permise sera toujours la même. La particularité de ce spectre
d’émission c’est qu’il peut avoir un effet miroir avec le spectre d’absorption.=> c’est pas tout le temps
mais quand ça arrive ça peut aider à trouver les longueurs d’onde.
Retenir : La fluorescence concerne les molécules il y a plusieurs transitions possibles mais il y en a que
certaines de permises et plusieurs a chaque fois car il y a plusieur électrons concerné et donc c’est pour
ca qu’on a des bandes et non pas des raies. Outre la longueur d’onde d’émission on à des longueurs
d’ondes parasites, ces raies parasites son dû à l’interaction entre les photons et les électrons du solvant,
on irradie la molécule mais le solvant aussi ça entraîne donc des interactions, et une lumière diffuse,
qu’on retrouve au niveau de la longueur d’onde d’excitation.
Donc on aura toujours une bande sur notre spectre, au niveau de la longueur d’onde d’excitation (ne pas
confondre avec la bande de fluorescence). => bande de Rayleigh
Qu’est-ce que la diffusion de Rayleigh ?
Une diffusion de la lumière à une longueur d’excitation
Qu’est-ce que la diffusion de Raman ?
Ce sont des raies moins intenses que la diffusion de Rayleigh (100 à 1000 fois plus faible) à une longueur d’onde supérieur à la longueur d’onde d’excitation.
C’est celle qui est
la plus problématique car c’est celle qui a la longueur d’onde la plus proche par rapport à la bande de
fluorescence, elle peut gêner le pic de fluorescence.
Si longueur d’onde augmente, c’est qu’elle est dû à la fluorescence.
Δλ est constant, vrai ou faux ?
C’est vrai.
Δλ (Rayleigh - Raman) = constant => l’écart entre les 2 bandes est toujours le même. Ces bandes ne
sont pas visibles en fluorescence mais peuvent donc gêner l’analyse du pic de fluorescence (bande de
Raman). Ces deux bandes là on les repère parce qu’on retrouve des harmoniques dans le spectre à 2λ.
Ce qui veut dire qu’à 2 fois λ on retrouve le même phénomène. (C’est comme ça qu’on les distingue de
la fluorescence). On remarque aussi une autre bande due à la lumière diffractée.
Qu’est-ce que le rendement quantique ?
C’est la capacité d’une molécule à fluorescer, mesuré par son rendement quantique ( Φ )
Φ = nb de molécules fluorescentes / nb totales de molécules excitées
Φ = 1 pour les molécules très fluorescentes
Φ = 0 pour les molécules non fluorescentes
=> le rendement quantique est donc un marqueur de fluorescence
Que faut-il pour qu’une molécule soit fluorescente ?
Pour qu’une molécule soit fluorescente, il y a 2 conditions :
- Il faut qu’elle absorbe (elle doit pouvoir être excitée)
- Il faut également que sa structure permette que le temps de relaxation rayonnant soit inférieur au
non-rayonnant, il faut donc que la structure le permette (structure rigide favorable)
- Il faut que l’émission se fasse d’un état excité singulet vers un état fondamental singulet sinon cela
correspond à de la phosphorescence.
Quels sont les facteurs qui favorisent la fluorescence ?
- L’aromaticité : Noyaux aromatiques (c’est aussi un bon critère
chromophore) > auront plus de chances de fluorescer. Attention certains
composés aromatiques ne fluorescent pas. - Le nombre de cycles et le degré de condensation => facteur favorisant
aussi la fluorescence : plus il y a de cycles accolés plus ça fluoresce
→ quinoléine Φ > 0 (fluoresce) et pyridine Φ = 0 (ne fluoresce pas) - hétérocycles accolés > hétérocycle simple
5 - La rigidité augmente aussi la fluorescence : le pont rigidifie la
molécule. Fluorène Φ = 1 et le biphényle Φ = 0,2. - Certains groupements électrodonneurs sont activateurs de fluorescence, il y a une influence de la
substitution : –NR > –NH > –OR > –OH - Viscosité: gène la mobilité donc le nombre de collisions et donc favorise la fluorescence
Quels sont les facteurs qui sont défavorables à la fluorescence ?
- Température : augmente la mobilité des espèces en solution ce qui va favoriser les collisions entre les
molécules et le solvant et va favoriser la relaxation non rayonnante. Donc plus la température augmente
et moins c’est en faveur de la fluorescence. (intensité moins importante)
La température favorise aussi la diminution de la viscosité et donc les chocs augmentent ce qui
défavorise la fluorescence. - Certains groupements électroattracteurs diminuent la fluorescence (carboxylique,ester, aldéhyde,
cétone, amine, amide …) : —CO2H , –CO2R , –CHO, – COR, –NO2, —NO - Quencheurs : molécules entraînant la diminution voire la disparition de la fluorescence des molécules
auxquelles elles sont additionnées. Ils peuvent entraîner soit l’augmentation de la température soit les
réactions entre les quencheurs et les molécules comme le Tryptophane.
3. Effet de la concentration
Effet intéressant : l’intensité du rayonnement fluorescent qu’on mesure est directement proportionnel à
la concentration de l’analyte étudié : c’est bien car c’est linéaire (donc analyse quantitative possible) - Conditions : si c telle que A < 0,05 ou T > 90% (T : transmittance) alors :
F = K c
avec : - F : puissance du rayonnement fluorescent
- c : concentration de l’analyte
- K : facteur de proportionnalité
Si on a une concentration telle que A > 0,05 ou T < 90% alors la relation n’est plus linéaire (plus de
proportionnalité) → auto désactivation ou self-quenching => Les molécules sont donc trop
nombreuses en solution et vont alors se désactiver entre elles à cause des collisions (important :
collision = baisse de fluorescence).
On peut voir soit un palier soit un maximum en étudiant F=f(c).
Jusqu’à une certaine concentration on va avoir une linéarité, avec la fluorescence directement
proportionnelle à la concentration et puis au bout d’un certain temps on a soit un pallier ou soit une
désactivation. Les molécules sont en quantité tellement importante qu’il va y avoir un écart à la linéarité
du a la relaxation rayonnante. Lorsqu’on fait une étude en fluorescence il faut toujours travailler dans un
panel de concentrations assez large (dans un facteur au moins de 100) de manière à vérifier qu’on n’est
pas déjà dans une zone de désactivation. C’est donc un paramètre très important.
Rmq : les méthodes fluorimétriques sont 10 à 1000 fois plus sensible que les méthodes d’absorption UV
visible (C= e-4) → Concentration très faible (e-9 M) - F est proportionnel à P0 (puissance du faisceau incident) => si P0 augmente alors F aussi (cela permet
à la méthode d’être beaucoup plus sensible) - A (Absorbance) quant à elle est proportionnelle aux logarithmes (c’est un rapport entre le faisceaux
émergent et le faisceaux incident = log (P0/P)) => si P0 augmente alors P augmente et A est constant.
4. Effet du solvant
Plus le solvant est polaire, plus la longueur d’onde
d’émission sera grande mais moins intense,
donc on a un déplacement de la longueur d’onde
d’émission dans le visible lorsqu’on augmente la
polarité du solvant, par contre l’intensité diminue.
5. Effet de λ d’excitation - Intensité de fluorescence directement lié à la longueur
d’onde d’excitation. Ainsi l’intensité de fluorescence =
f(λ exc) - Allure du spectre indépendante de l’intensité de
fluorescence ≠ f(λ exc)
Pour choisir la molécule d’excitation on va regarder le
spectre d’absorption, on peut excité a plusieur longueur
d’onde.
La longueur d’onde d’excitation provoque un phénomène sur
l’intensité et sur l’allure de la courbe sans changer la
longueur d’onde d’émission.
Retenir : Quelque soit la longueur d’onde d’excitation, l’allure du spectre d’émission sera la même. Par
contre l’intensité du spectre d’émission sera différente en fonction de la longueur d’onde d’excitation. Si
la longueur d’onde d’excitation correspond à la longueur d’onde d’absorption maximale, on aura une
intensité maximale pour l’émission.
6. Effet du pH
Seulement si on a une molécule à caractère acido-basique
Quand on a travaillé sur l’absorption, on avait dit que le pH avait directement un impact sur les spectres
d’absorption. Donc si un facteur a un impact sur l’absorption alors il en a aussi un sur l’émission.
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Spectres d’absorptions ≠ donc Spectres d’émission ≠
On va avoir un effet sur le spectre d’absorption qui est directement dû à l’effet sur le diagramme
énergétique, (le diagramme énergétique d’une molécule basique n’est pas le même que celui de son
acide conjugué).
On a un spectre d’absorption qui diffère , et comme on a un effet miroir forcément on va avoir un impact
sur le spectre de fluorimétrie. En fonction du pH on a pas du tout la même allure de spectre.
Les composants sont les mêmes que pour l’absorption moléculaire, vrai ou faux ?
C’est vrai.
Les composants sont les mêmes que pour l’absorption moléculaire
On a la source d’énergie qui va permettre d’exciter la molécule. Contrairement à la spectroscopie
d’absorption, la détection se fait à 90° du faisceau incident pour limiter les effets parasites de Raman et
Rayleigh. La cuve doit être transparente pour le faisceau incident et aussi pour le faisceau émergent
=> cuves quartz transparentes sur toutes les faces ou plaques 96 puits.
On a des spectrofluorimètres à 96 puits. Il existe comme pour les spectrophotomètres des mono ou des
doubles faisceaux.
Quelles sont les applications ?
Il existe 2 voies d’applications pour les ions :
etude quantitative (que par étalonnage externe), thermodynamique , cinétique , acidité
- Méthode directe : agent chélatant + analyte = fluorescence → Cations
- Méthode indirecte : par l’étude du quenching de la molécule → Anions
=> Permet les études quantitatives, car la fluorescence est directement proportionnelle à la
concentration (droites d’étalonnage)
=> Permet la détermination de constantes thermodynamique (pKa, complexation., cinétique)
Application aux espèces inorganiques : complexation avec des
molécules fluorescentes comme hydroxy8-quinoleine (qui complexe
Al3+ et Be2+) / flavanol (qui complexe Zr4+ et Sn2+)
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Applications aux espèces organique :
- Bcp applications quantitatives : stéroïdes, chlorophylle, alcaloïdes de l’ergot, flavonoïdes, nombreux
médicaments (quinine, acide salicylique…)
- Prélèvement médicaux
- Marquages cellulaires : Filtres utilisés bleu (lambda max = 450 nm) - vert (540 nm) - rouge (680 nm).
Pour qu’un filtre puisse être utilisé, il faut que le déplacement de Stokes soit > 20 nm
NB : Molécule qui fluoresce = chromophore
Mitochondrie
On a mis cette mitochondrie dans un milieu
contenant de la carbocyanine lipophile qui est une
molécule très sensible au potentiel. Lorsque le
potentiel est négatif, elle va s’agréger, cette
molécule fluoresce dans le rouge. Lorsque cette
molécule est sous forme de monomère, elle
fluoresce dans le vert. Pour savoir si notre
membrane a un potentiel négatif ou pas, on peut la
marquer avec cette molécule de carbocyanine et
regarder si elle fluoresce ou pas et cela nous
donnera une bonne indication de son potentiel
membranaire.
Par rapport à la spectrométrie atomique, La spectrophotométrie atomique concerne les atomes à l’état liquide, solide ou gazeux, vrai ou faux ?
Faux : uniquement à l’état gazeux
Par rapport à la spectrométrie atomique, En spectrophotométrie atomique, on observe un spectre de bandes, vrai ou faux ?
Faux : Atome = Spectre de Raie / Molécule = Spectre de bande
Par rapport à la spectrométrie atomique, La désolvatation et l’atomisation des particules se font grâce à une flamme, vrai ou faux ?
C’est vrai.
Par rapport à la spectrométrie atomique, En SAA (Absorption de la flamme), le dispositif nécessite une source de lumière spécifique à l’élément analysé, vrai ou faux ?
C’est vrai.
Qu’est-ce que l’absorption de la flamme ?
- Concentration déduite de la mesure de l’absorption de la
lumière des atomes restés à l’EF quand ils sont éclairés par
une source lumineuse convenable - Nécessité d’une source lumineuse pour avoir une
absorption (obligé d’avoir un spectre lumineux au départ) +
une flamme - λ absorbée spécifique de l’élément étudié, raies sombre dans un spectre continu de lumière
- Mono-élémentaire : source lumineuse spécifique de l’élément à doser, élément par élément par la
source lumineuse doit être spécifique de l’élément - Interférences avec raies d’émission, matrice, bruit de fond (corrigé par l’appareillage)
10 - Doser qu un élément à chaque fois car filtre qui ne laisse passer la longueur d onde spécifique de
l’élément: autant d analyses que d’éléments à analyser.
Qu’est-ce que l’émission de la flamme (SEA) ?
- Concentration déduite de l’intensité des radiations émises par la fraction d’atomes passés à l’EE
- Pas besoin de source lumineuse, on a juste besoin d’exciter les éléments et on regarder s’ils émettent
de la lumière - λ émise spécifique de l’élément étudié, les raies lumineuses apparaissent sur un écran sombre.
- Même longueur d onde en absorption et émission
- Intérêt est qu’on faire des analyses multi
élémentaires : filtre en sortie d’appareillage (car
pas besoin de source lumineuse) (cas de la torche
plasma) - Interférences avec spectres d’émission des ions
générés (dû à l’ionisation de l’atome) - qu’on soit en SAA ou émission de flamme les raies sont au même endroit, soit on a une absorption ou
émission autour de 589 nm, les niveaux permis sont les mêmes - sodium : 2 raies d’émission / absorption
Il faut une flamme pour les deux pour vaporiser l’échantillon et exciter les électrons.
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Focus sur la source lumineuse nécessaire pour l’absorption de flamme : pour que l’absorption soit
optimisée, il faut que le faisceau incident ait une longueur d’onde égale à celle absorbée.
2 méthodes fréquemment utilisés :
1. L’étalonnage externe (le + courant) : le domaine de concentration dans lequel la linéarité existe est
étroit. On trace A = f(C), et on va obtenir des courbes qui sont soit linéaires ou soit avec coefficient.
(Similaire a une courbe d’étalonnage)
2. La méthode des ajouts dosés : des quantités connues et croissantes de l’élément à doser sont
ajoutées à l’échantillon. On trace A = f(q ou V) (cas des matrices très compliquées)
Rmq : - Méthode indirecte => étalonnage (courbe de calibration ou d’étalonnage) qui est fait à partir de
solutions synthétiques de l’analyte à doser de concentrations connues. On parle d’étalonnage
externe. - Méthode directe => titrage, relation à l’équivalence
Limite de détection : L’absorption atomique est en général plus sensible
que l’émission
atomique sauf pour les alcalins et alcalino terreux
Contrôle de la température de la flamme
Le réglage de la flamme est très important car il faut faire passer les échantillons au bon endroit, et le
résultat obtenu au niveau de la linéarité de réponse dépend de cela.
Le contrôle de la température est indispensable, en effet on veut que tous les atomes de l’échantillon
soient concernés par l’excitation. Plus on va chauffer, plus on a de probabilité d’exciter les atomes qui
sont présents, ça veut dire qu’on va augmenter la population d’atomes excités dans la flamme, on va
augmenter la sensibilité.
Cette source d’énergie permet le passage de l’état fondamental vers l’état excité et donc l’énergie est +/-
forte en fonction de l’élément étudié. Le rapport entre le nombre d’atomes excités (Ne) et le nombre
d’atomes à l’état fondamental (N0) est très sensible à la température et à l’élément considéré.
On voit dans ce tableau que la population excitée augmente avec la température, càd que la
température va favoriser l’émission par rapport à l’absorption :
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➔ Quand la T°C augmente le nombre d’e- excité augmente : favorable à l’émission ➔ Toujours plus
d’atomes qui restent à l’état fondamental car le rapport entre les deux est toujours inférieur à 1 : N0»_space;
Ne : absorption favorisée
➔ Détection fiable à partir de Ne / N0 > 10-7
!!! Sinon pas d’excitation.
