Elisa

Question 1

Τι είναι η Elisa;

Answer 1

Είναι μια διαδεδομένη μορφή αναλυτικής βιοχημικής δοκιμής που χρησιμοποιεί ένα υπό-είδος ετερογενούς και στερεάς φάσης ενζυμικής ανοσοανίχνευσης συνήθως ενός αντιγόνου ή ενός αντισώματος σε υγρό δείγμα.

Question 2

Τι χρησιμοποιείται για δοκιμασίες στερεάς φάσης για αντισώματα;

Answer 2

Προσδέματα σημασμένα με ραδιοϊσότοπα και προσδέματα σημασμένα με ένζυμα (ELISA).

Question 3

Πώς γίνεται η ακινητοποίηση του αντιγόνου/ αντισώματος σε στερεό υπόστρωμα;

Answer 3

Είτε με προσκόλληση σε σφαιρίδια (αγαρόζη, κυτταρίνης, πολυακρυλαμίδης κλπ) είτε με χημικό δεσμό είτε με φυσική προσρόφηση σε πλαστικές επιφάνειες με ασθενείς δεσμούς (ηλεκτροστατικές, υδρόφοβες)

Question 4

Από τι εξαρτάται η επιτυχία της ELISA;

Answer 4

Το αντιδραστήριο που ακινητοποιείται στο υπόστρωμα, το αντίσωμα που επιλέγεται, την παρασκευή και τη σταθερότητα του συμπλόκου αντισώματος-αντιγόνου, τον τρόπο ανίχνευσης του τελικού προϊόντος.

Question 5

Ποιο ένζυμο χρησιμοποιείται συνήθως;

Answer 5

Η υπεροξειδάση.

Question 6

Πώς ανιχνεύεται το τελικό προϊόν συνήθως;

Answer 6

Με χρωματομετρική μέθοδο, το αποτέλεσμα απαιτεί μια απλή φωτομέτρηση για να εξαχθεί και το προϊόν είναι σταθερό για αρκετό διάστημα.

Question 7

Ποια είναι η αρχή της μεθόδου ELISA;

Answer 7

Βασίζεται στην ειδική και αμφίδρομη σύνδεση αντιγόνου - αντισώματος, που σχηματίζει ένα σύμπλοκο το οποίο διαφοροποιείται από τα άλλα μόρια στο δείγμα.

Question 8

Ποιες είναι οι κατηγορίες ELISA;

Answer 8

Ο κλασικός τύπος ELISA όπου δεσμεύεται αντιγόνο σε συγκεκριμένο υπόστρωμα και υποκατηγοριοποιείται στην στην άμεση ELISA (άμεση-άμεση ELISA και άμεση-ανταγωνιστική) και στην έμμεση ELISA. Η άλλη κατηγορία είναι αυτές όπου αντί του αντιγόνου δεσμεύεται αντίσωμα στο υπόστρωμα και είναι είτε ανταγωνιστικές ή μη ανταγωνιστικές (σε αυτές ανήκει η sanwich ELISA).

Question 9

Ποια είναι η προετοιμασία των πλακιδίων;

Answer 9

Αντιγόνα επωάζονται σε ισότονο διάλυμα άλατος, μέσα σε φρεάτια ειδικών πλαστικών πλακών ή σε σωληνάρια. Μικρές ποσότητες προσροφώνται στην πλαστική επιφάνεια. Το ελεύθερο αντιγόνο απομακρύνεται με πλύση. Στο πλακίδιο πρέπει να προστεθεί περίσσεια άσχετης πρωτεϊνης για να κορεστεί όλη η πλαστική επιφάνεια ώστε να παρεμοπιδιστεί οποιαδήποτε μη ενζυμική σύνδεση των μετέπειτα προστιθέμενων πρτεϊνών.

Question 10

Πώς γίνεται η προσθήκη του υπο αναζήτηση αντισώματος;

Answer 10

Προστίθεται το εξεταζόμενο δείγμα που περιέχει πιθανώς το υπό αναζήτηση αντίσωμα και το οποίο συνδέεται με το αντιγόνο. Οι μη προσδεμένες πρωτεϊνες απομακρύνονται με πλύση.

Question 11

Πώς ανιχνεύεται το τυχόν προσδεμένο αντίσωμα;

Answer 11

Προστίθενται σημασμένα αντι-αντισώματα. Συνήθως τα αντι-αντισώματα σημαίνονται μέσω της ομοιοπολικής τους σύνδεσης με ένζυμο. Το μη συνδεδεμένο αντι-αντίσωμα απομακρύνεται με πλύση. Το σημασμένο αντίσωμα καθίσταται ορατό με την προσθήκη χρωμογόνου , το οποίο είναι ένα άχρωμο υπόστρωμα επάνω στο οποίο δρα το ενζυμικό τμήμα του αντισώματος για να παραχθεί ένα έγχρωμο τελικό προϊόν.

Question 12

Πώς μετριέται η ποσότητα του εξταζόμενου αντισώματος;

Answer 12

Μετριέται εκτιμώντας την ποσότητα του έγχρωμου τελικού προϊόντος με σάρωση της οπτικής πυκνότητας των φρεάτιων της πλάκας. Αυτή η μέθοδος επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάγνωση πολλών φρεατίων ταυτόχρονα. Όταν αυξάνεται η ποσότητα του εξεταζόμενου αντισώματος τότε το σήμα αυξάνεται από ένα βασικό επίπεδο, μέσω μιας γραμμικής περιοχή σε ένα πλατώ. Οι τίτλοι του αντισώματος μπορούν να ανιχνευθούν σωστά μόνο στη γραμμική περιοχή.

Question 13

Ποια είναι η ευαισθησία της τεχνικής της έμμεσης ELISA;

Answer 13

1-50 ng/ml ειδικού αντισώματος.

Question 14

Ποιος είναι ο επισημασμένος ιχνηθέτης στην sandwich ELISA;

Answer 14

Είναι το αντίσωμα. Αρχικά τα μη επισημασμένα αντισώματα προσροφούνται σε μια στερεή επιφάνεια και μετά τοποθετείται το αντιγόνο.

Question 15

Ποια είναι τα στάδια της ELISA;

Answer 15

1. Η καθήλωση αντισώματος στην πλάκα μικροτιτλοδότησης
2. Προσθήκη καζεϊνης ή BSA (blocking step)
3. Προσθήκη αντιγόνου και επώαση.
4. Πλύσεις για απομάκρυνση μη δεσμευμένων αντισωμάτων
5. Προσθήκη αντισώματος συνδεδεμένου με ένζυμο και επώαση.
6. Πλύσεις για απομάκρυνση μη δεσμευμένου αντισώματος
7. Προσθήκη υποστρώματος TMB και επώαση για παραγωγή έγχρωμου προϊόντος
8. Προσθήκη διαλύματος τερματισμού
9. Μέτρηση οπτικής απορρόφησης στο σωστό μήκος κύματος (εκεί που απορροφά το έγχρωμο προϊόν της ενζυμικής αντίδρασης.

Question 16

Τι μπορούμε να κάνουμε εναλλακτικά για το στάδιο 4 της sandwich ELISA;

Answer 16

Μπορεί να γίνει προσθήκη αντισώματος μη συνδεδεμένου με ένζυμο αλλά με 3ο αντίσωμα (HRP linked antibody) έναντι του 2ου αντισώματος.

Question 17

Σε τι αποσκοπεί η προσθήκη BSA ή καζεΪνης;

Answer 17

Στο να μπλοκαριστούν οι μη ειδικές προσροφήσεις άλλων πρωτεϊνών (αντιγόνων) στην πλάκα μικροτιτλοδότησης και προκύψουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα.

Question 18

Ποια μέθοδο χρησιμοποιήσαμε εμείς;

Answer 18

Την έμμεση ELISA για ποσοστικοποίηση του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης σε δείγμα.

Question 19

Ποιο είναι το αντιγόνο μας;

Answer 19

Το εξωκυττάριο τμήμα της α υπομονάδας του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης.

Question 20

Σε τι pH πραγματοποιήσαμε την διαδικασία;

Answer 20

Σε βασικό (9,6).

Question 21

Πόσες πλύσεις κάνουμε αρχικά και με τι;

Answer 21

3 με PBS TWEEN 20.

Question 22

Σε τι αναλογία αραίωσης βρίσκεται το αντίσωμα;

Answer 22

1: 1000 σε διάλυμα blocking.

Question 23

Με ποιο ένζυμο γίνεται η σήμανση του αντι-αντισώματος;

Answer 23

Με την υπεροξειδάση του μαύρου ραπανιού.

Question 24

Τι είναι το TMB;

Answer 24

Είναι το χρωμογόνο υπόστρωμα για το ένζυμο της υπεροξειδάσης του μαύρου ραπανιού. Το TMB οξειδώνεται παρουσία της υπεροξειδάσης και δίνει ένα μπλε χρώμα που απορροφά στα 370 και 652 nm.

Question 25

Γιατί προσθέτουμε H2SO4;

Answer 25

Για να κάνουμε το pH από βασικό όξινο και να τερματιστεί η αντίδραση. Το χρωμογόνο γίνεται από μπλε σε κίτρινο.

Question 26

Τι συμβαίνει στο plateau;

Answer 26

Δεν παρατηρείται αλλαγή στο χρώμα (ομοιόμορφο).

Question 27

Σε τι χρησιμεύουν τα controls;

Answer 27

Τα θετικά controls είναι για επιβεβαίωση της ανίχνευσης (αναμενόμενο το έγχρωμο προϊόν). Στα αρνητικά, αφαιρώ από την αντίδραση ένα συστατικό και το αναμενόμενο είναι ένα μη έγχρωμο προϊόν.