Elisa Flashcards
Τι είναι η Elisa;
Είναι μια διαδεδομένη μορφή αναλυτικής βιοχημικής δοκιμής που χρησιμοποιεί ένα υπό-είδος ετερογενούς και στερεάς φάσης ενζυμικής ανοσοανίχνευσης συνήθως ενός αντιγόνου ή ενός αντισώματος σε υγρό δείγμα.
Τι χρησιμοποιείται για δοκιμασίες στερεάς φάσης για αντισώματα;
Προσδέματα σημασμένα με ραδιοϊσότοπα και προσδέματα σημασμένα με ένζυμα (ELISA).
Πώς γίνεται η ακινητοποίηση του αντιγόνου/ αντισώματος σε στερεό υπόστρωμα;
Είτε με προσκόλληση σε σφαιρίδια (αγαρόζη, κυτταρίνης, πολυακρυλαμίδης κλπ) είτε με χημικό δεσμό είτε με φυσική προσρόφηση σε πλαστικές επιφάνειες με ασθενείς δεσμούς (ηλεκτροστατικές, υδρόφοβες)
Από τι εξαρτάται η επιτυχία της ELISA;
Το αντιδραστήριο που ακινητοποιείται στο υπόστρωμα, το αντίσωμα που επιλέγεται, την παρασκευή και τη σταθερότητα του συμπλόκου αντισώματος-αντιγόνου, τον τρόπο ανίχνευσης του τελικού προϊόντος.
Ποιο ένζυμο χρησιμοποιείται συνήθως;
Η υπεροξειδάση.
Πώς ανιχνεύεται το τελικό προϊόν συνήθως;
Με χρωματομετρική μέθοδο, το αποτέλεσμα απαιτεί μια απλή φωτομέτρηση για να εξαχθεί και το προϊόν είναι σταθερό για αρκετό διάστημα.
Ποια είναι η αρχή της μεθόδου ELISA;
Βασίζεται στην ειδική και αμφίδρομη σύνδεση αντιγόνου - αντισώματος, που σχηματίζει ένα σύμπλοκο το οποίο διαφοροποιείται από τα άλλα μόρια στο δείγμα.
Ποιες είναι οι κατηγορίες ELISA;
Ο κλασικός τύπος ELISA όπου δεσμεύεται αντιγόνο σε συγκεκριμένο υπόστρωμα και υποκατηγοριοποιείται στην στην άμεση ELISA (άμεση-άμεση ELISA και άμεση-ανταγωνιστική) και στην έμμεση ELISA. Η άλλη κατηγορία είναι αυτές όπου αντί του αντιγόνου δεσμεύεται αντίσωμα στο υπόστρωμα και είναι είτε ανταγωνιστικές ή μη ανταγωνιστικές (σε αυτές ανήκει η sanwich ELISA).
Ποια είναι η προετοιμασία των πλακιδίων;
Αντιγόνα επωάζονται σε ισότονο διάλυμα άλατος, μέσα σε φρεάτια ειδικών πλαστικών πλακών ή σε σωληνάρια. Μικρές ποσότητες προσροφώνται στην πλαστική επιφάνεια. Το ελεύθερο αντιγόνο απομακρύνεται με πλύση. Στο πλακίδιο πρέπει να προστεθεί περίσσεια άσχετης πρωτεϊνης για να κορεστεί όλη η πλαστική επιφάνεια ώστε να παρεμοπιδιστεί οποιαδήποτε μη ενζυμική σύνδεση των μετέπειτα προστιθέμενων πρτεϊνών.
Πώς γίνεται η προσθήκη του υπο αναζήτηση αντισώματος;
Προστίθεται το εξεταζόμενο δείγμα που περιέχει πιθανώς το υπό αναζήτηση αντίσωμα και το οποίο συνδέεται με το αντιγόνο. Οι μη προσδεμένες πρωτεϊνες απομακρύνονται με πλύση.
Πώς ανιχνεύεται το τυχόν προσδεμένο αντίσωμα;
Προστίθενται σημασμένα αντι-αντισώματα. Συνήθως τα αντι-αντισώματα σημαίνονται μέσω της ομοιοπολικής τους σύνδεσης με ένζυμο. Το μη συνδεδεμένο αντι-αντίσωμα απομακρύνεται με πλύση. Το σημασμένο αντίσωμα καθίσταται ορατό με την προσθήκη χρωμογόνου , το οποίο είναι ένα άχρωμο υπόστρωμα επάνω στο οποίο δρα το ενζυμικό τμήμα του αντισώματος για να παραχθεί ένα έγχρωμο τελικό προϊόν.
Πώς μετριέται η ποσότητα του εξταζόμενου αντισώματος;
Μετριέται εκτιμώντας την ποσότητα του έγχρωμου τελικού προϊόντος με σάρωση της οπτικής πυκνότητας των φρεάτιων της πλάκας. Αυτή η μέθοδος επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάγνωση πολλών φρεατίων ταυτόχρονα. Όταν αυξάνεται η ποσότητα του εξεταζόμενου αντισώματος τότε το σήμα αυξάνεται από ένα βασικό επίπεδο, μέσω μιας γραμμικής περιοχή σε ένα πλατώ. Οι τίτλοι του αντισώματος μπορούν να ανιχνευθούν σωστά μόνο στη γραμμική περιοχή.
Ποια είναι η ευαισθησία της τεχνικής της έμμεσης ELISA;
1-50 ng/ml ειδικού αντισώματος.
Ποιος είναι ο επισημασμένος ιχνηθέτης στην sandwich ELISA;
Είναι το αντίσωμα. Αρχικά τα μη επισημασμένα αντισώματα προσροφούνται σε μια στερεή επιφάνεια και μετά τοποθετείται το αντιγόνο.
Ποια είναι τα στάδια της ELISA;
- Η καθήλωση αντισώματος στην πλάκα μικροτιτλοδότησης
- Προσθήκη καζεϊνης ή BSA (blocking step)
- Προσθήκη αντιγόνου και επώαση.
- Πλύσεις για απομάκρυνση μη δεσμευμένων αντισωμάτων
- Προσθήκη αντισώματος συνδεδεμένου με ένζυμο και επώαση.
- Πλύσεις για απομάκρυνση μη δεσμευμένου αντισώματος
- Προσθήκη υποστρώματος TMB και επώαση για παραγωγή έγχρωμου προϊόντος
- Προσθήκη διαλύματος τερματισμού
- Μέτρηση οπτικής απορρόφησης στο σωστό μήκος κύματος (εκεί που απορροφά το έγχρωμο προϊόν της ενζυμικής αντίδρασης.
Τι μπορούμε να κάνουμε εναλλακτικά για το στάδιο 4 της sandwich ELISA;
Μπορεί να γίνει προσθήκη αντισώματος μη συνδεδεμένου με ένζυμο αλλά με 3ο αντίσωμα (HRP linked antibody) έναντι του 2ου αντισώματος.
Σε τι αποσκοπεί η προσθήκη BSA ή καζεΪνης;
Στο να μπλοκαριστούν οι μη ειδικές προσροφήσεις άλλων πρωτεϊνών (αντιγόνων) στην πλάκα μικροτιτλοδότησης και προκύψουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα.
Ποια μέθοδο χρησιμοποιήσαμε εμείς;
Την έμμεση ELISA για ποσοστικοποίηση του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης σε δείγμα.
Ποιο είναι το αντιγόνο μας;
Το εξωκυττάριο τμήμα της α υπομονάδας του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης.
Σε τι pH πραγματοποιήσαμε την διαδικασία;
Σε βασικό (9,6).
Πόσες πλύσεις κάνουμε αρχικά και με τι;
3 με PBS TWEEN 20.
Σε τι αναλογία αραίωσης βρίσκεται το αντίσωμα;
1: 1000 σε διάλυμα blocking.
Με ποιο ένζυμο γίνεται η σήμανση του αντι-αντισώματος;
Με την υπεροξειδάση του μαύρου ραπανιού.
Τι είναι το TMB;
Είναι το χρωμογόνο υπόστρωμα για το ένζυμο της υπεροξειδάσης του μαύρου ραπανιού. Το TMB οξειδώνεται παρουσία της υπεροξειδάσης και δίνει ένα μπλε χρώμα που απορροφά στα 370 και 652 nm.
