DMEP - Transgénèse Flashcards
Qu’est-ce qu’un animal transgénique?
Un animal dont le génome a été modifié.
Soit par transgénèse classique ou recombinaison homologue (KO-KI)
Donnez les principes de la transgénèse classique
Ajout d’une nouvelle séquence dans le génome.
L’intégration est aléatoire.
Donnez les principes du KO ou KI
Modification d’une séquence endogène par recombinaison homologue.
(L’intégration peut alors être contrôlée)
Vrai/Faux :
Les modifications du génome d’un animal transgénique ne sont pas transmissibles aux générations suivantes
Faux,
Les modifications sont transmissibles par la lignée germinale
Donnez les étapes de l’obtention de souriceaux transgéniques (5-6)
- Traitement hormonal de souris femelles pour induire une super-ovulation
- Accouplement avec des mâles
- Sélection des embryons au stade 1 cellule
- Injection de l’ADN dans le pronucléus mâle
- Transfert dans l’oviducte de femelles pseudogestantes
- 30% des embryons ont intégré le transgène
Quels sont les différents types de transgénèse classique ? (2)
Transitoire : pas besoin de faire naître les souriceaux, on s’intéresse à l’effet du transgène sur le dvpt foetal et embryonnaire
Stable : On étudie les régions régulatrices d’un gène chez l’adulte et l’effet de la surexpression d’une protéine mutée.
Que sont les founders?
Les animaux naissants ayant intégré le transgène (environ 30%) que l’on sélectionne et fait se croiser entre eux pour amplifier la lignée.
Aussi appelés Fondateurs et F0
Sous quelle forme est injecté l’ADN dans les pronucléi lors de la transgénèse classique?
Sous forme linéaire : permet une insertion plus facile
Quels sont les différents transgènes (3) (dans le cadre de la transgénèse classique)
- Plasmide ( inf 20kB)
- Bact. Artificial Chromosome (BAC) (100-300kb)
- YAC ( 150-2000 kb)
Quels sont les aléas de l’insertion de plasmide ? (4)
Comment y pallier?
- Extinction d’un gène endogène
- Activation ectopique du transgène (si placé avant Enhancers)
- Extrinction du transgène (si placée avant Silencers)
- Insertion de plusieurs copies du transgène
L’utilisation de BAC ou YAC permet de pallier à ces problèmes
car :
-expression indépendante du site d’insertion
- expression dépendante du nb de copies
Quelles sont les différentes recombinaisons homologues possibles ? (2)
- Recombinaison générale
(n’importe quelles seq. homologues peuvent être recombinées - Recombinaison site-spécifique
( seule 1 seq. particulière va être reconnue et recombinée par une enzyme, ex CRE Recombinase)
Comment produire des souris par recombinaisons homologues (8 étapes)
- Culture de cellules souches embryonnaires (ES)
- Construction du vecteur d’invalidation
- Electroporation
- Prolifération des ES ayant recombiné le transgène
- Injections des ES recombinées dans le blastocyste d’un embryon
- Implantation dans des femelles pseudogestantes
- Obtention de souris chimères
- Croisement successifs pour obtenir un chimérisme de + en + important
Comment sont récupérées et cultivées les cellules souches embryonnaires?
Elles proviennent de la masse cellulaire interne (ICM) des blastocystes (au jour 4)
Elles sont cultivées avec des facteurs empêchant leur différenciation (car ce sont des cellules pluripotentes qui autrement se différencieraient en cellules du mésoderme, ectoderme etc…)
Donnez des exemple de vecteur d’invalidation
- Résistance à un antibiotiques (seules les cellules ayant intégré le vecteur vont survivre)
ex : Néomycine - Résistance à des toxines
ex : DTA
Que sont les cassettes de sélection positive et négative?
Cassette de sélection positive :
Se trouvent à l’intérieur des bras d’homologie.
Permet de ne sélectionner que les cellules qui ont recombiné le transgène.
Cassette de sélection négative :
se trouvent à l’extérieur des bras d’homologie.
Que permet un gène rapporteur? (3)
- suivre l’expression endogène du gène à l’état hétérozygote
- suivre le destin de cellules mutantes à l’état homozygote
- purifier des cellules d’intérêt expérimental ou thérapeutique (cytométrie en flux)
Qu’est-ce que la recombinase Cre ?
Un enzyme qui catalyse la recombinaison entre deux sites Lox.
Que sont les sites Lox?
Séquences contenant des nucléotides palindromiques à chaque extrémités reconnues par la Cre.
Ces séquences ne sont pas présentes chez les eucorayotes
Qu’est-ce que la recombinase FLP
Fonctionnement idem à la recombinase CRE mais pour les sites FRT.
Quelles sont les régions reconnues et recombinées par la FLP?
Les sites FRT
34pb dont 13 nucléotides palindromiques aux extrémités.
Sites absents du génome murin
Comment réaliser un KO inductible?
En utilisant un promoteur spécifique à un tissu
Et en utilisant un récepteur nucléaire comme le Récepteur aux Oestrogènes (ER)
La Cre ne pourra transloquer au noyau qu’après injection de 4-OHT (Tamoxifen) ce qui permet de contrôler de manière temporelle le moment où la recombinaison (et donc le KO) a lieu
Quelle est l’utilité d’un KO inductible?
ça permet d’observer les effets de la délétion d’un gène à un moment précis du dvpt ou au stade adulte.
Car parfois le KO est fatal
