Diagnostico Viral Flashcards
Importancia del Diagnóstico Viral
Importancia a nivel individual:
Identificar el agente etiológico en infecciones virales letales para desarrollar estrategias de tratamiento y seguimiento.
Proveer óptimo seguimiento y tratamiento en infecciones virales crónicas.
Importancia a nivel de salud pública:
Mantener bancos de sangre libres de virus.
Supervisar y seguir programas de vacunación.
Identificar brotes y virus no habituales.
Reconocer circulación de nuevos agentes virales.
Enfoque del Diagnóstico Virológico
Diagnóstico viral clínico:
Basado en signos y síntomas para orientar la etiología (ej. sintomatología de la peste cristal sugiere infección por varicelas zoster).
Diagnóstico viral de laboratorio:
Confirmación del agente etiológico a partir de muestras adecuadas.
Consideraciones para una Muestra Adecuada
Aspectos del paciente y situación epidemiológica: Ej. lactante o mayor, temporada.
Estructura y patogenia viral del agente sospechoso.
Objetivo de la prueba: Conocer sobre el virus o la respuesta inmune.
Tipos de Muestras
Localizadas: Muestras del órgano blanco (ej. torulado nasofaríngeo para infecciones respiratorias).
Sistémicas: Muestras en sitios generales o representativos.
Traslado de Muestras
Condiciones: En frío a 4°C, usando hielo húmedo o sistemas refrigerantes.
Medios de transporte: Adecuados y con normas de bioseguridad.
Evitar congelación y descongelación: Puede disminuir la viabilidad del virus.
Enfoque del Estudio de la Muestra
Detección directa: Virus completo o componentes.
Detección indirecta: Respuesta inmune generada.
Patogenia Viral y Diagnóstico
Conocer el tropismo del virus y evolución clínica para seleccionar la muestra y técnica diagnóstica adecuada.
Análisis de laboratorio para detección confirmatoria del agente viral o respuesta inmune.
Detección del Virus
Agente Viral Completo:
Microscopía Electrónica:
No se usa comúnmente en clínica.
Permite ver estructuras virales directamente.
Requiere equipo especializado, complejo, y gran cantidad de muestra.
Limitada sensibilidad.
Aislamiento Viral:
Detecta partículas virales con capacidad replicativa.
Muestra se transporta en frío para preservar capacidad infectiva.
Inoculación en células y observación de efectos citopáticos (ej. sincicios por virus sincicial).
Efectos citopáticos compartidos por muchos virus, por lo que se necesita técnicas adicionales como inmunofluorescencia.
Ventajas y Desventajas del Aislamiento Viral
Ventajas:
Detecta virus viables o con capacidad infectiva.
El medio de cultivo puede ser almacenado para estudios posteriores.
Desventajas:
El efecto citopático puede demorar, no siempre aplicable en clínica por tiempos prolongados.
No todos los virus tienen modelos celulares adecuados para análisis.
Requiere gran infraestructura en clínica.
Detección de Componentes Virales: Inmunoanálisis
Técnicas de inmunoanálisis para detectar antígenos virales:
Inmunofluorescencia directa e indirecta
Técnica de ELISA
Inmunocromatográfica
Test rápidos como la aglutinación
Antigenemia, Shell vial, etc.
Métodos de Inmunoanálisis:
Método Directo: Anticuerpo antiviral marcado se une al antígeno.
Método Indirecto: Anticuerpo antianticuerpo viral marcado se une al anticuerpo viral.
Inmunoradionálisis: Usa radioisótopos.
Inmunofluorescencia: Usa fluorocromos.
ELISA: Usa enzimas.
ELFA: Usa sustratos fluorogénicos.
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)
Proceso:
Permeabilización: Células tratadas para permitir acceso al anticuerpo.
Adición de Primer Anticuerpo: Específico para el antígeno viral.
Adición de Segundo Anticuerpo: Conjugado con fluoroforo.
Visualización: Bajo microscopio de fluorescencia con luz específica.
Ejemplos de uso:
Virus respiratorios: sincicial, parainfluenza, influenza A y B, adenovirus, metapneumovirus.
Test ELISA
Sistema de Captura:
Directo: Anticuerpo de captura en pocillo, interacción con antígeno, adición de anticuerpo conjugado con enzima, cambio de color con sustrato.
Indirecto: Anticuerpo de captura, adición de anticuerpo primario, segundo anticuerpo conjugado con enzima, cambio de color con sustrato.
Tiempo:
Directo: Hasta 4 horas.
Inmunocromatografía (Test Rápido)
Proceso:
Depósito de Muestra: Zona con anticuerpos específicos marcados.
Movimiento del Complejo: Antígeno-anticuerpo viaja a través de la tira.
Zona de Captura: Anticuerpo de captura retiene el complejo.
Zona de Control: Anticuerpo de control asegura funcionamiento del dispositivo.
Ejemplo: Test de VIH para detectar antígenos y/o anticuerpos de VIH.
Técnicas de Estudio del Genoma Viral
Enfoques:
Amplificación del Blanco: PCR, transcriptasa inversa-PCR (para RNA).
Amplificación de la Señal: Transcripción in vitro TMA.
Pasos del PCR:
Denaturación: Separación de hebras de DNA a 94-95°C.
Apareamiento: Hibridación de cebadores a 45-65°C.
Elongación: Incorporación de nucleótidos a 72°C.
Tipos de PCR:
Convencional: Cualitativo, visualización por electroforesis.
En Tiempo Real: Cualitativo y cuantitativo, medición con fluorescencia.
Ventajas del PCR y PCR en Tiempo Real
Ventajas:
Rapidez.
Sensibilidad.
Especificidad.
Puede utilizar diversos tipos de muestras.
Requiere poca cantidad de muestra.
Aplicaciones Clínicas del PCR Cuantitativo:
Determinar replicación activa del virus.
Monitorizar tratamientos antivirales (HCV, CMV, RBV, HBV, VIH).
Detección de la Respuesta Inmune
Objetivo:
Evaluar anticuerpos de la respuesta inmune adaptativa humoral mediante técnicas serológicas.
Clasificación General:
IgM: Primeros anticuerpos en aparecer durante la respuesta inmune. Su presencia indica infección reciente.
IgG: Aparecen después de IgM y permanecen en el tiempo. Indican exposición pasada o actual al patógeno, presentes en infecciones agudas, persistentes latentes y crónicas.
Detección de Anticuerpos: Métodos Serológicos
Objetivo:
Encontrar anticuerpos específicos antivirales en el suero del paciente.
Métodos Clásicos:
Neutralización
Inhibición de la Hemaglutinación
Fijación del Complemento
Métodos Actuales:
ELISA (Enzima-Linked Immunosorbent Assay)
Western Blot
Aglutinación con Látex
Inmunocromatografía (rápido)
Seroconversión:
Evaluar la presencia de anticuerpos mediante muestras de suero iniciales y posteriores para detectar cambios de seronegativo a seropositivo.
ELISA para Anticuerpos
Proceso:
Recubrimiento de Pocillos: Con antígeno viral.
Adición de Suero del Paciente: Interacción con anticuerpos específicos.
Adición de Anticuerpo Conjugado con Enzima: Se une a los anticuerpos.
Añadido de Sustrato: Cambio de color si la enzima está presente.
Western Blot
Proceso:
Membrana de Nitrocelulosa: Soporte con antígenos del virus (proteínas).
Adición de Suero del Paciente: Reconoce y se une a los antígenos en la membrana.
Detección de Bandas Positivas: Indica presencia de anticuerpos específicos.
Diagnóstico Molecular: POCT
POCT (Point-of-Care Testing): Ensayo automatizado rápido para detectar virus.
Equipos:
ALERE Influenza A&B: Amplificación isotérmica, detecta influenza A y B en 15 minutos.
Cobas-Liat: Detecta influenza A/B con PCR, resultados en 20 minutos.
Xpert Fly Assay: PCR en tiempo real para influenza y H1N1, resultados en 75 minutos.
FilmArray: Ensayo múltiple, purifica DNA/RNA y realiza PCR múltiple.
Métodos de Detección Múltiples
Multiplex XMAP: Utiliza esferas fluorescentes con sondas específicas para detectar hasta 100 patógenos en una sola muestra. Ejemplo: patógenos respiratorios.
FilmArray: Realiza detección múltiple de patógenos, usado en paneles respiratorios y gastrointestinales.
¿Por qué es importante discriminar el genotipo viral en epidemiología?
Resistencia a antivirales.
Epidemiología molecular: Establecer políticas de salud pública.
Genotipos asociados a cuadros más graves.
¿Qué técnicas se utilizan para determinar la variabilidad viral?
PCR con enzimas de restricción (RFLP): Bandas específicas para genotipos.
Hibridación con sondas.
Secuenciación.
Hibridación con Sondas
Secuencias nucleotídicas complementarias al genotipo específico se adhieren a una membrana. Se detecta el genotipo presente mediante marcas.
Ejemplo: Virus papiloma humano, con genotipos de alto y bajo riesgo.
Secuenciación
Secuenciación: Análisis filogenético de genomas virales. Ejemplo: SARS-CoV-2 y su relación con otros coronavirus.
Epidemiología molecular: Identificar si el virus fue adquirido localmente o importado. Ejemplo: Virus del sarampión.
