Crispr-cas9 Flashcards
que veut dire l’acronyme CRISPR?
Clustered Regularly interspaced short palindromic repeats
quels sont les grandes étapes du fonctionnement de la machinerie CRISPR-Cas9?
- ARNg trouve et se lie à la séquence d’ADN auquel il est complémentaire
- Cas9 couple les 2 brins d’ADN
- cellule reconnait que l’ADN est endommagé et essaye de la réparer
quel est la limitation de la machinerie CRISPR-Cas9?
Cellule répare majoritairement avec le non-homologous end joining ce qui induit beaucoup de délétions et insertions
quel est le PAM pour la Cas9 de la bactérie streptocoque pyogènes?
NGG
pourquoi est-ce que la cellule répare majoritairement avec le non-homologous end joining et non le homologous direct repair?
avec le HDR on doit fournir un gabarit à la cellule pour la réparation alors que NHEJ non
comment fonctionne la méthode Guide-Seq?
On induit une cassure double-brin avec une cas9. dans cette coupure nous insérons un oligonucléotide qui est phosphorylé ce qui agis comme un étiquette et ensuite on peut séquencer cette région précise en raison de son étiquette
La méthode de Guide-Seq est surtout utiliser pour quoi?
détecter les événements d’édition du génome qui sont off-target sans devoir séquencer tout le génome
quels sont les avantages de différentes Cas9?
elles reconnaissent différent PAM donc peuvent couper à différente endroit dans le génome
quel est l’avantage de la saCas9?
elle est plus petite il est donc plus facile à l’insèrer dans les virus adéno-associés
quel est la reaction chimique lorsqu’on change une cytosine pour une thymine?
déamination
quel est le désavantage/la limitation de l’utilisation du base editing?
l’édition se fait pour tout les bases cibles qui sont à une distance appropriée du PAM
vrai ou faux: le prime editing permet de changer n’importe quelle nucléotide dans le génome humain par un autre nucléotide
vrai
la machinerie du prime editing est former de quoi?
spCas9 nickase + Reverse transcriptase + pegRNA
quels sont les trois régions importantes du pegRNA?
PBS: primer binding site, se lie au brin coupé qui doit être corriger
RTT: reverse transcriptase template, est le gabarit pour la reverse transcriptase
Spacer: reconnait 20 nos dans le génome
quel est la limitation du prime editing?
la modification des nts peut être perdu en raison de la resolution du “Flap”
quels sont les méthodes d’améliorer le prime editing?
- répéter le traitement
- ajouter une cassure supplémentaire
- muté le PAM après l’avoir reconnu
- insurer une mutation additionnel (silencieuse ou non)
- optimiser la longueur du RTT et PBS
- Utiliser un engineered pegRNA
- Utiliser Pemax
- utiliser le bon type de cellule
le PE3 est formé de quoi?
(PE2+Cas9)+(sgRNA+Cas9)
comment est-ce que le PE3 ajoute une cassure supplémentaire?
le sgRNA coupler à sa Cas9 reconnait le brin qui est non-corrigé et induit une coupure dans celle ci
comment est-ce que l’utilisation du PE3 améliore le prime editing ?
la coupure du brin non-corrigé pousse la cellule à utiliser le flap 3’ contenant la mutation corrigé pour résoudre le problème des deux flaps
comment est-ce que la mutation du PAM peut améliorer le prime editing?
en induisant une mutation dans le pam en meme temps de corrige la mutation voulue, ça fait en sorte que la machinerie Cas9 ne pourra pas se relier au brin et le re-editer
comment est-ce que l’utilisation d’un epegRNA améliore le prime editing?
le epegRNA contient un pseudoknot ce qui prévient sa dégradation par des exonucléases de la cellule
Quelle est la différence entre le PE3 et le PEmax?
PEmax contient 2 mutations additionnelles pour prévenir son inhibition par des protéines MMR et elle contient des codons RT humanisé ce qui augment son expression ans les cellules humains
quels sont les 6 méthodes de livraison?
-plasmides
- AAV
- LNP
- EV
- VLP
- Chitosan nanoparticles
quel est la limitation de l’utilisation des AAV?
pour livrer la machinerie du prime editing deux AAV doivent être utiliser pour la livrer ce qui diminue l’efficacité de l’édition
