Cours 4 - Chromatographie par échange d'ions Flashcards
1
Q
Quel est le principe de base de la chromatographie par échange d’ions ?
A
→ Une interaction entre des ions de charges opposées.
2
Q
Qu’exploite-t-on dans la chromatographie par échange d’ions ?
A
→ Les groupes chargés de la protéine d’intérêt.
3
Q
Quelles sont les deux formes de chromatographie par échange d’ions ?
A
→ Chromatographie par échange de cations
→ Chromatographie par échange d’anions
4
Q
Dans la chromatographie par échange de cations, quelle est la charge de la résine ?
A
→ La résine est chargée négativement.
Puisque la résine doit fixer les cations (charges positives)
5
Q
Dans la chromatographie par échange d’anions, quelle est la charge de la résine ?
A
→ La résine est chargée positivement.
6
Q
Quel type d’interaction permet la rétention des molécules dans la chromatographie par échange d’ions ?
A
→ Une interaction électrostatique entre les charges opposées de la résine et des molécules d’intérêt.
7
Q
Quelles sont les trois étapes de la chromatographie par échange d’ions ?
A
→ Première étape : Capturer (isoler et concentrer)
→ Deuxième étape : Purifier (retirer les grosses impuretés)
→ Troisième étape : Polir (retirer les petites impuretés)
8
Q
Quel type de colonne et de résine est utilisé lors de la première étape (capturer) ?
A
→ Une grosse colonne avec une résine ayant une grande capacité.
9
Q
Quelle est la particularité de la colonne et de la résine utilisées lors de la deuxième étape (Purifier) ?
A
→ Une colonne moins grosse avec une résine plus uniforme et des particules plus petites.
10
Q
À quoi se lient les groupes chargés d’une molécule dans la chromatographie par échange d’ions ?
A
→ À l’échangeuse d’ions de charges opposées.
11
Q
Quelles sont les deux étapes principales de la chromatographie par échange d’ions ?
A
→ 1) Adsorption
→ 2) Désorption
12
Q
Comment influence la force de l’adsorption sur la désorption ?
A
→ Plus l’adsorption est forte, plus la désorption est difficile.
13
Q
Quel est le rôle du sel dans la chromatographie par échange d’ions ?
A
→ Il agit comme un compétiteur général et permet d’éluer les molécules fixées.
14
Q
Quelle est la relation entre la charge nette d’une molécule et son adsorption à la résine ?
A
Plus la charge nette de la molécule est élevée, → plus son adsorption à la résine est forte.
15
Q
Comment varie l’absorption des molécules en fonction de leur charge nette ?
A
→ Une molécule avec une charge nette plus élevée sera plus fortement absorbée par la résine.
16
Q
Pourquoi une molécule faiblement chargée interagit-elle moins avec la résine ?
A
→ Parce que l’interaction électrostatique est plus faible, ce qui diminue l’adsorption.
17
Q
Quel facteur influence directement la force d’adsorption d’une molécule à la résine dans la chromatographie par échange d’ions ?
A
→ La charge nette de la molécule.
18
Q
Quelles sont les deux stratégies principales pour la désorption en chromatographie par échange d’ions ?
A
→ Diminuer la charge nette de la molécule par un changement de pH (pH 6-9).
→ Augmenter la concentration d’ions compétitifs (exemples : NaCl ou KCl).
19
Q
Quel sel est utilisé pour les deux types d’échange d’ions (échange de cations et d’anions) ?
A
→ On utilise le même sel, comme NaCl ou KCl, pour les deux types d’échange.
20
Q
Quel est l’effet de l’augmentation de la charge nette d’une protéine sur la désorption ?
A
→ Une protéine avec une charge nette plus élevée nécessitera une concentration plus importante de sels pour être désorbée.
21
Q
Pourquoi une concentration plus élevée de sels est-elle nécessaire pour la désorption d’une protéine fortement chargée ?
A
→ Parce que l’interaction électrostatique entre la protéine et la résine est plus forte, nécessitant plus d’ions compétitifs pour rompre cette liaison.
22
Q
Quels acides aminés ont un groupe fonctionnel COOH ?
A
→ Acide Aspartique
→ Acide Glutamique
23
Q
Quels acides aminés ont un groupe fonctionnel chargé positivement à pH physiologique ?
A
→ Lysine (groupe ammonium, pKa = 10,4)
→ Arginine (groupe guanidinium, pKa = 12,0)
24
Q
Quel est le pKa moyen du groupe imidazole de l’histidine ?
A
→ 6,2
25
Pourquoi l’histidine n’est-elle pas chargée à pH physiologique ?
→ Son pKa est de 6,2, donc à un pH de 6-9, la majorité de ses molécules sont sous forme non chargée.
26
Quel est l’effet d’un tampon à pH 6-9 sur la charge des acides aminés ?
→ Acide aspartique et acide glutamique : chargés négativement (-)
→ Lysine et arginine : chargés positivement (+)
→ Histidine : neutre (pas de charge)
27
Qu'est-ce que le point isoélectrique (pI) d'une molécule ?
→ C'est le pH auquel la molécule a une charge nette nulle.
28
Que se passe-t-il lorsque pH < pI ?
→ La molécule possède un excès de charges positives.
29
Que se passe-t-il lorsque pH > pI ?
La molécule possède un excès de charges négatives.
30
Quel type d'échangeur d’ions utilise-t-on si une molécule a une charge positive (pI > pH) ?
→ Échangeur de cations.
31
Quel type d'échangeur d’ions utilise-t-on si une molécule a une charge négative (pH > pI) ?
→ Échangeur d’anions.
32
Comment choisir le pH optimal en chromatographie par échange d’ions ?
→ On choisit un pH éloigné du pI pour assurer une charge nette suffisante et favoriser la rétention sur la résine.
33
Quels sont les trois principaux types d’échangeurs d’anions ?
→ Diethylaminoethyl (DEAE)
→ Quaternary aminoethyl (QAE)
→ Quaternary ammonium (Q)
34
Quelle est la caractéristique commune à tous les échangeurs d’anions ?
→ Ils possèdent un groupe chargé positivement entre pH 6 et 9.
35
Quel type de charge doit avoir une molécule pour interagir avec un échangeur d’anions ?
→ Elle doit être chargée négativement (anionique).
36
Quels sont les trois principaux types d’échangeurs de cations ?
→ Carboxyméthyl (CM) – échangeur faible
→ Sulfopropyl (SP) – échangeur fort
→ Méthyl sulfonate (S) – échangeur fort
37
Quelle est la caractéristique commune à tous les échangeurs de cations ?
→ Ils possèdent un groupe chargé négativement sur la résine.
38
Quel type de charge doit avoir une molécule pour interagir avec un échangeur de cations ?
→ Elle doit être chargée positivement (cationique).
39
Quelles sont les étapes importantes dans la chromatographie par échange d'ions? (4)
1) Étape d’équilibration
2) Application de l'échantillon
3) Élution par gradient
4) Régénération
40
Quel est le tampon utilisé lors de l’étape d’équilibration ?
→ Tampon A (tampon d’équilibration).
41
Peut-on utiliser des volumes d’échantillon différents pour l’équilibration dans la chromatographie à échange d'ions?
→ Oui, cette étape est possible avec un petit ou un grand volume d’échantillon.
→ Parce qu’il y a une étape d’adsorption, et la quantité de soluté à fixer ne dépend pas du volume injecté.
42
Quelle est la deuxième étape de la chromatographie par échange d’ions ?
→ Application de l’échantillon.
43
Pourquoi est-il important d’utiliser un élucident en gradient dans la deuxième étape de la chromatographie par échange d’ions?
→ Pour séparer efficacement les protéines en fonction de leur charge et de leur affinité avec la résine.
44
Quel tampon est utilisé pour l’application de l’échantillon dans la deuxième étape de la chromatographie par échange d’ions?
→ Tampon A : Tampon de lyse.
45
Quelle est la troisième étape de la chromatographie par échange d’ions ?
→ Élution par gradient.
46
Quel est le principe de l’élution par gradient en chromatographie par échange d’ions ?
→ Augmenter progressivement la concentration en sel pour déplacer les protéines fixées sur la résine.
47
Quel est le rôle du tampon B dans l’élution ?
→ Le tampon B contient plus de sel que le tampon A et sert à compétitionner les interactions ioniques entre les protéines et la résine.
48
Quelle est la dernière étape de la chromatographie par échange d’ions ?
→ La régénération.
49
Quel est l’objectif de l’étape de régénération ?
→ Restaurer la résine pour permettre son réemploi dans une nouvelle séparation.
50
Quels tampons sont utilisés pour régénérer la colonne ?
→ 100% Tampon B (riche en sel) pour enlever tous les résidus de protéines.
→ 100% Tampon A pour reconditionner la résine à l’état initial.
51
Quel est l’effet de la taille des particules de la résine sur la résolution de la chromatographie par échange d'ions ?
→ Plus la taille des particules est petite, meilleure est la résolution.
52
Quels sont les critères de sélection d’une résine échangeuse d’ions ?
→ Type d’échange (cations ou anions).
→ Taille des particules (influence la résolution).
→ Capacité d’échange (quantité d’ions qu’elle peut fixer).
53
Quels sont les avantages de la chromatographie par échange d’ions ? (5)
→ Méthode très flexible (ajustement du sel et du pH).
→ Possibilité de choisir entre un échangeur cationique ou anionique.
→ Grande diversité de résines disponibles.
→ Coût faible des résines.
→ Compatible avec des détergents sans charge et l’urée, permettant la purification même en conditions dénaturantes.
54
Quelles sont les limites de la chromatographie par échange d’ions ? (3)
→ Manque de spécificité : cette méthode ne distingue pas toujours efficacement les protéines similaires.
→ Impossible d’utiliser la guanidine comme dénaturant, car elle est chargée et interagirait avec la résine.
→ Nécessite un système à deux pompes pour un fonctionnement optimal (ex. FPLC).
55
Sur quel critère repose la séparation en chromatographie par filtration sur gel ?
→ Sur la taille moléculaire des protéines.
56
Pourquoi les gels utilisés en filtration sur gel sont-ils poreux ?
→ Pour permettre aux protéines de pénétrer dans les pores, influençant ainsi leur vitesse d’élution.
57
Quelle est la principale différence entre la chromatographie par filtration sur gel et les autres types de chromatographie ? IMPORTANT
→ C’est la seule méthode qui ne repose pas sur une étape d’absorption et de désorption.
58
Y a-t-il un compétiteur dans la chromatographie par filtration sur gel ?
→ Non, car la séparation est basée uniquement sur la différence de taille moléculaire.
59
Comment la taille des protéines influence-t-elle leur élution en chromatographie par filtration sur gel ?
→ Les grosses molécules sortent en premier car elles traversent plus rapidement la colonne.
→ Les petites molécules sortent en dernier car elles pénètrent plus profondément dans les pores du gel.
60
Pourquoi la chromatographie par filtration sur gel est-elle particulièrement efficace à l’étape finale d’une purification ?
→ Parce qu’elle sépare les protéines en fonction de leur taille, ce qui permet de retirer efficacement les petites impuretés résiduelles.
61
Que se passe-t-il si une protéine est trop petite pour le gel utilisé ?
→ Elle pénètre complètement dans les pores du gel et subit un retard important de migration.
62
Que se passe-t-il si une protéine est trop grande pour le gel utilisé ?
→ Elle ne pénètre pas dans les pores et élue rapidement avec la phase mobile.
63
Pourquoi chaque gel a-t-il un temps de séparation différent ?
→ Parce que la porosité du gel varie en fonction de sa conception et de la gamme de tailles des protéines ciblées.
64
Quelle est la relation entre la pénétration des protéines dans le gel et leur migration ?
→ Plus une protéine pénètre dans les pores du gel, plus son élution est retardée.
65
Comment les protéines sont-elles réparties entre la phase mobile et la phase stationnaire dans la chromatographie par filtration sur gel?
→ La phase mobile (tampon) entraîne les protéines à travers la colonne,
→ La phase stationnaire (gel) ralentit les protéines qui pénètrent dans ses pores.
66
Quelle gamme de tailles de protéines peut être séparée efficacement avec un gel conçu pour des protéines de 20 à 100 kDa ?
→ Les protéines entre 25 kDa et 75 kDa Da subiront une séparation efficace.
- Moins de 20kDa génèrent un signal, mais sont pas séparées.
- Plus de 100kDa génèrent un signal, mais sont pas séparées.
67
Quelle est la différence entre une protéine sans accès, avec accès partiel et avec accès complet aux pores ?
→ Sans accès : Protéines trop grandes pour entrer dans les pores, elles sortent en premier.
→ Accès partiel : Protéines de taille intermédiaire, elles pénètrent partiellement et sont modérément retardées.
→ Accès complet : Protéines très petites, elles entrent complètement dans les pores et sortent en dernier.
68
Quelle est la première étape de la chromatographie par filtration sur gel ?
→ L’étape d’équilibration.
69
Quel est le rôle du tampon d’équilibration (Tampon A) en filtration sur gel ?
→ Il prépare la colonne en stabilisant les conditions chimiques avant l’injection de l’échantillon.
- notamment en conditions dénaturantes pour favoriser la séparation des protéines.
70
Quelle est l’étape la plus importante en chromatographie par filtration sur gel ?
→ L’application de l’échantillon, car elle détermine la séparation efficace des protéines.
71
Pourquoi la quantité d’échantillon est-elle critique en filtration sur gel ?
→ C’est le seul type de chromatographie où la quantité d’échantillon est un facteur clé, car une trop grande quantité réduit la résolution.
72
Que se passe-t-il si la quantité totale de protéines est trop élevée (Chromatographie par filtration sur gel)?
→ La séparation devient moins précise et la résolution du chromatogramme est affectée.
73
Pourquoi la filtration sur gel est-elle souvent utilisée comme troisième étape d’une purification ?
→ Parce qu’il est difficile de minimiser le volume d’échantillon dès les premières étapes, alors qu’à la fin, l’échantillon est plus concentré et purifié.
74
Pourquoi n’y a-t-il pas d’absorption/désorption en filtration sur gel ?
→ Parce que la séparation repose uniquement sur la taille des protéines, et non sur des interactions chimiques avec la résine.
75
Quelle est l’étape d’élution en chromatographie par filtration sur gel ?
→ Elle consiste à faire circuler le tampon d’élution (Tampon A) à travers la colonne pour séparer les protéines selon leur taille.
76
Pourquoi aucun gradient n’est-il utilisé pour l’élution en filtration sur gel ?
→ Parce que la séparation repose uniquement sur la taille des protéines, et non sur des interactions chimiques avec la résine.
77
Pourquoi la hauteur de la colonne influence-t-elle la résolution en filtration sur gel ?
→ Plus la colonne est longue, plus la séparation est fine et meilleure est la résolution.
78
Faut-il utiliser un tampon différent pour l’élution en filtration sur gel ?
→ Non, un seul tampon suffit, car le mécanisme de séparation n’implique pas d’adsorption/désorption.
79
Quel est l’effet d’une taille de particule plus petite en chromatographie par filtration sur gel ?
→ Une meilleure résolution, car les protéines sont mieux séparées.
80
Comment la pression dans la colonne est-elle affectée par la taille des particules ?
→ Plus les particules sont petites, plus la pression dans la colonne est élevée.
81
Dans quel cas particulier la chromatographie par filtration sur gel est-elle particulièrement utile ?
→ Pour la purification des protéines dans les corps d’inclusion.
82
Quels sont les principaux avantages de la chromatographie par filtration sur gel ? (5)
→ Plusieurs résines différentes disponibles,
→ Coût abordable des résines,
→ Possibilité d'utiliser des détergents et des dénaturants,
→ Méthode efficace pour la purification des protéines dans les corps d'inclusion,
→ Équipement peu coûteux.
83
Quel type d'élution est possible avec la filtration sur gel ?
→ L'élution linéaire.
84
Pourquoi la chromatographie par filtration sur gel n’est pas adaptée pour purifier de grandes quantités de protéines ?
→ Elle est moins efficace pour les échantillons volumineux, ce qui la rend plus adaptée à des étapes finales de purification.
85
Quel est le principal inconvénient des résines utilisées dans la chromatographie par filtration sur gel?
→ Elles ne sont pas très résistantes ni très durables.
86
Pourquoi les vitesses d’écoulement (flow rates) sont-elles très faibles ?
→ Il y a une relation entre la taille des particules et la pression dans la colonne :
- Plus la taille des particules est petite, meilleure est la séparation, mais la vitesse d’écoulement est réduite.
- Pour augmenter la vitesse, il faudrait des particules plus grandes, mais cela diminue la résolution.
87
Quel est l’impact de la pression dans la colonne sur la séparation ?
→ Une pression plus élevée peut augmenter la vitesse d’écoulement, mais elle peut aussi abîmer le gel et réduire la précision de séparation.
88
Sur quel type d’interaction repose la séparation dans la chromatographie en phase inverse ?
→ Sur les interactions hydrophobes entre la phase stationnaire et les molécules à séparer.
89
Quelles sont les deux grandes étapes de la chromatographie en phase inverse ?
- Absorption : Fixation des protéines hydrophobes sur la phase stationnaire.
- Désorption : Éluées grâce à un solvant organique.
90
Pourquoi un solvant organique est-il utilisé dans chromatographie en phase inverse?
→ Il sert à désorber les protéines en compétition avec les interactions hydrophobes.
91
Pourquoi la chromatographie en phase inverse est-elle souvent utilisée en dernière étape de purification ?
→ Car elle permet une purification très efficace, mais peut être dénaturante, ce qui la rend idéale pour les étapes finales où la structure native est moins critique.
92
Comment les acides aminés hydrophobes interagissent-ils avec la résine en chromatographie en phase inverse ?
→ Ils se lient aux groupements hydrophobes de la résine via des interactions hydrophobes.
93
Quel est le rôle du solvant organique dans chromatographie en phase inverse?
→ Il agit comme un compétiteur, en remplaçant les interactions hydrophobes et en désorbant la protéine.
94
Pourquoi la chromatographie en phase inverse est-elle souvent utilisée en dernière étape de purification ?
- Elle est efficace pour enlever les dernières impuretés.
- Mais elle peut dénaturer la protéine, ce qui n’est pas toujours souhaitable.
- Peut être utile pour protéines dans des corps d’inclusion.
95
Comment la désorption des protéines est-elle provoquée
dans la chromatographie en phase inverse?
→ En augmentant la concentration en solvant organique, ce qui compétitionne avec les résidus hydrophobes de la résine et entraîne l’élution.
96
L’adsorption des protéines en chromatographie en phase inverse est-elle réversible ?
→ Oui, elle varie en fonction du changement de polarité du solvant.
97
Quelle est la première étape de la chromatographie en phase inverse ?
→ L’étape d’équilibration.
98
Quel tampon est utilisé lors de l’étape d’équilibration ? Caractéristiques?
→ Le Tampon A.
→ Il a une très faible concentration de solvant organique.
99
Quelle est la deuxième étape de la chromatographie en phase inverse ? Quels types de molécules sont appliqués dans cette étape ?
→ L’application de l’échantillon.
→ Des protéines avec différents niveaux d’hydrophobicité et des contaminants très hydrophobes.
100
Quel est l’effet du tampon A sur l’échantillon appliqué ?
→ Il permet une faible adsorption et désorption des molécules, facilitant l’application même avec une petite quantité d’échantillon.
101
Pourquoi est-il possible d’utiliser une petite quantité d’échantillon dans cette étape (phase invese) ?
→ Parce que l’adsorption et la désorption sont possibles dans ces conditions.
102
Quelle est la troisième étape de la chromatographie en phase inverse ?
→ L’étape d’élution.
103
Quel type d’élution est utilisé dans étape 2 Phase invese ? Qu’est-ce qui est augmenté progressivement durant cette étape ?
→ Une élution par gradient.
→ La concentration de solvant organique.
104
Quel est l’effet de l’augmentation du solvant organique sur les molécules adsorbées ? (étape 2, phase inverse)
→ Elle favorise la désorption progressive des molécules selon leur hydrophobicité.
105
Dans quel ordre les protéines sont-elles éluées en fonction de leur hydrophobicité ? (Phase inverse)
→ Les protéines peu hydrophobes sont éluées en premier, suivies des protéines moyennement hydrophobes, puis des protéines très hydrophobes.
106
Quels solvants organiques sont mentionnés pour l’élution ? Étape 2 Phase inverse
→ Le méthanol et l’acétonitrile.
107
Quels sont les avantages et inconvénients du méthanol ?
→ Moins cher, mais c'est un alcool qui produit du gaz et de la chaleur.
108
Quels sont les avantages et inconvénients de l’acétonitrile ?
→ Plus cher et plus toxique, mais il ne produit pas de gaz ni de chaleur.
109
Quelle est la quatrième et dernière étape de la chromatographie en phase inverse ?
→ L’étape de régénération.
110
Quel tampon est utilisé lors de cette étape de régénération (Phase inverse)?
→ Le Tampon B.
→ Il est composé à 100 % de solvant organique.
111
Quel est l’objectif de la régénération en chromatographie en phase inverse ?
→ Éliminer les protéines et contaminants restants afin de restaurer la colonne pour une utilisation future.
112
Quel est l’effet du Tampon B sur les protéines hydrophobes ? Phase invese
→ Il favorise leur désorption complète.
113
Dans quel ordre les protéines sortent-elles durant cette étape de régénération - Phase inverse ?
→ Les protéines très très hydrophobes sortent en dernière, tandis que les protéines légèrement hydrophobes sortent plus rapidement.
114
Quels sont les différents types de colonnes utilisées en chromatographie en phase inverse ?
→ C₁₈, C₈, C₄, C₃, C₂, C₁.
115
Quel est l’impact de la longueur de la chaîne carbonée sur l’hydrophobicité de la colonne ?
→ Plus la séquence de carbones est longue, plus la colonne est hydrophobe.
116
Quel type de colonne est recommandé pour une petite protéine ? Pourquoi ?
→ La colonne C₁₈, car elle est plus hydrophobe.
117
Quel type de colonne est recommandé pour une grosse protéine ? Pourquoi ?
→ Les colonnes C₂ ou C₁, car elles sont moins hydrophobes et donc plus adaptées aux protéines de grande taille.
118
Quels sont les principaux avantages de la chromatographie en phase inverse ? (4)
→ Elle offre une bonne résolution,
→ Efficace pour la purification des protéines présentes dans les corps d'inclusion,
→ Utilise des résines résistantes et durables,
→ Permet des vitesses d’écoulement variées.
119
Pourquoi la chromatographie en phase inverse est-elle efficace pour la purification des protéines ?
→ Elle est particulièrement adaptée à la purification des protéines présentes dans les corps d’inclusion.
120
Quels sont les principaux inconvénients de la chromatographie en phase inverse ? (3)
→ Coût élevé des colonnes et de l’équipement,
→ Inadaptée aux grosses protéines et aux protéines très hydrophobes,
→ Risque de dénaturation des protéines d’intérêt.
121
Quel est le principe de la détermination de la concentration d’une protéine par absorption UV ?
→ Elle repose sur l’absorption de la lumière à 280 nm, principalement due aux résidus aromatiques de la protéine.
122
Pourquoi l’absorption à 280 nm est-elle précise ?
→ Parce qu’elle est directement liée à la composition en Tyr (tyrosine), Trp (tryptophane) et Cystine dans la séquence de la protéine.
123
Quel est l’ordre d’importance des résidus pour l’absorption UV ?
→ Trp > Tyr > Cystine.
124
Quelle est la loi utilisée pour calculer l’absorbance d’une protéine ?
→ A = εlC
125
Quelle technique est utilisée pour évaluer la pureté d’une protéine ?
→ L’électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE).
126
Quel est le rôle du SDS dans cette technique ?
→ Il dénature les protéines et leur confère une charge négative uniforme, permettant leur séparation uniquement en fonction de leur taille.
127
Sur quelle base les protéines sont-elles séparées dans un gel de polyacrylamide ?
→ Sur la base de leur taille moléculaire.
128
Quels sont les avantages et limites du SDS-PAGE en termes de précision et de sensibilité ?
→ La technique est très précise, mais la sensibilité dépend de la méthode de détection utilisée.
129
Quels sont les deux principaux types de détection utilisés après une électrophorèse SDS-PAGE ?
→ Le bleu de Coomassie Brilliant et la coloration à l’argent.
130
Quelle technique est utilisée pour vérifier l’identité d’une protéine ?
→ La spectrométrie de masse.
131
Pourquoi la spectrométrie de masse est-elle utilisée pour identifier les protéines ?
→ Parce qu’elle est très précise et très sensible.
132
Quel est l’inconvénient principal de la spectrométrie de masse ?
→ L’équipement est très cher.
133
Quels sont les avantages de la spectrométrie de masse ?
→ Elle permet une identification très précise des protéines, y compris des modifications post-traductionnelles.
134
Quelle est la principale limitation de la synthèse chimique de l’ARN ?
→ Elle est limitée aux petits ARN.
135
Quelle enzyme est utilisée pour la synthèse enzymatique de l’ARN in vitro ?
→ L’ARN polymérase du bactériophage T7.
136
Quels sont les composants essentiels à la réaction de transcription in vitro pour l'ARN polymérase du bactériophage T7 ?
→ Une matrice d’ADN.
→ NTPs (nucléosides triphosphates), Mg²⁺, pH 8.0, et une température de 37°C.
137
Quels sont les sous-produits de la réaction de transcription in vitro pour l'ARN polymérase du bactériophage T7 ?
→ Des transcrits abortifs (ARN incomplets) et du pyrophosphate (Ppi).
138
Quel est le premier élément ajouté pour faciliter la purification de l’ARN polymérase T7 ?
→ Une fusion avec His-tag dans le vecteur d’expression.
139
Quel est le rôle du His-tag dans la purification ?
→ Il permet une affinité spécifique avec la résine de nickel, facilitant ainsi la première étape de purification.
140
Quelles sont les étapes principales de la purification de l’ARN polymérase T7 ? (4)
- Purification avec la résine de nickel
- Purification avec un échangeur d’anions à pH = 8,0
- Purification par filtration sur gel
- Vérification de la pureté
141
Quels sont les principaux avantages de cette méthode de purification de l’ARN ? (3)
→ Très bonne résolution,
→ Pas besoin d’instruments de chromatographie,
→ Permet de purifier de grandes quantités d’ARN (plusieurs mg).
142
Quels sont les principaux inconvénients de cette méthode ? (3)
→ Elle est longue et fastidieuse,
→ Dénature l’ARN systématiquement,
→ Peut entraîner une contamination avec des oligomères d’acrylamide.
143
Quels sont les deux composants d’un ARN de fusion ?
→ L’ARN d’intérêt et un tag.
144
Quel est le rôle du tag dans cette méthode de purification ?
→ Il contient une séquence d’ARN ayant une forte affinité pour une protéine ou un peptide spécifique.
145
Comment l’interaction entre le tag et la phase stationnaire permet-elle la purification ?
→ Une résine est fabriquée avec une protéine ou un peptide qui présente une forte affinité pour le tag, permettant de capturer sélectivement l’ARN de fusion.
146
Quel est l’objectif principal de la purification par affinité avec le ARiBo-Tag ? Quelle est la particularité de l’ARN produit avec cette méthode ?
→ Maximiser le rendement et la pureté de l’ARN produit.
→ Il est fusionné à un ARiBo-Tag.
147
Quel est le rôle du ARiBo-Tag dans cette purification ?
→ Il permet une interaction spécifique facilitant l’isolement et la purification de l’ARN.
148
Qu’est-ce que GST-λN ? Comment GST-λN est-il produit ?
→ Une protéine de fusion contenant la glutathion S-transférase (GST) et le domaine λN.
→ Par expression à partir d’un vecteur contenant un promoteur, le gène GST et le gène λN.
149
Quelle sont les étapes de la purification par affinité avec le ARiBo-Tag ?
1) Transcription in vitro de l’ARN fusionné à ARiBo
2) Immobilisation de l’ARN
3) Auto-clivage avec la GlcN6P et élution de l’ARN
150
Comment le ribozyme glmS est-il activé ?
→ Il est activé par le GlcN6P (glucosamine-6-phosphate),
→ Le ribozyme ne s’active pas, donc l’ARN reste lié à la résine et n’est pas élué (état OFF).
