cours 4 Flashcards
types de sondes
- peinture chromosomique
- sonde à séquence répétitive (sonde centromérique, sonde télomérique)
- sonde à squence unique
but et fonctionnement d’une sonde à peinture chromosomique
couvre de manière spécifique une paire de chromosome entière
, pour anomalie de nombre ou une anomalie de structure identifié au caryotype (translocation, chromosome marqueur)
but et fonctionnement d’une sonde centromérique
sonde d’ADN des centromère–>séquence répétitive alpha satellite spécifique à chacun des chromosomes
pour anomalie de nombre ou de structure
but et fonctionnement d’une sonde télomérique
sequence répétée et identique à l’extrémité de chacun des bras chromosomiques (TTAGGG)
permet de determiner l’intégrité d’un bras chromosomique
but et fonctionnement d’une sonde à séquence unique
les plus utilisées
utilise une séquece d’une région spécifique du génome ou l’ADN n’Est pas rptitif
permet de diagnostiqer une microdélétion et une microduplication (la taille peut etre plus grande que celle de la sonde)
sil n’y a pas de signal cela signifie que la séquence nest pas présente donc délétion donc syndrome
comment choisir la sonde
a laide des information clinique (il faut dire quelle region on veut cibler pour quil puisse en lab repondre a notre question) et il y a toujours une sonde controle
quand est ce quon utilise FISH
Diagnostic cytogénétique:
-Préciser une anomalie vue en cytogénétique classique et qui n’a pu être identifiée précisément en raison de sa complexité
-Diagnostic de micro-remaniements chromosomiques, non visibles au caryotype
-FISH interphasique pour le diagnostic rapide
avantage de fish
donne une image directe de la localisation d’un gène sur un chromosome et ne necessite pas que ce gene soit exprimé ni que son produit soit caractérisé.
permet la détection de ces anomalies invisibles au microscope optique nécessite l’utilisation de sondes pour les mettre en évidence( Le caryotype est donc normal)
microremaniement cest quoi
Syndromes associés à une microdélétion chromosomique ou a une microduplication ainsique les remaniement cryptiques (ex: Remaniements des régions subtélomériques, remaniements interstitiels)
microdélétion récurrentes (quest ce qui fait défaut)
région chormosomique fréquemment délété ont autour des séquences répétées similaire: DNA low copy repeats
-normalment, lors de la recombinaison les chromatides non sœur homologues vont se retrouver base par base de manière très serée. MAIS peut avoir erreur d’appariement, surtout lorsque les séquences sont presque identique ce qui entraine recombinaison des homologues inégale car une chromatide va hérité des deux copies de la région entreles séquences répété et lautre naura pas ces région internes. ensuite le gamète fécondé peut contenir l’homologue dupliqué ou délété
syndrome de Digeorges (délétion, incidence, signe majeurs, autres signes)
-Délétion interstitielle de la région 22q11.2
-Incidence 1/4000
•93% survient de novo
•Pour un individu atteint: transmission 50% (la personne transmet soit son chromosome délété ou sont chromosome normal)
-Phénotype très variable (expressivité) même dans une même famille
-Signes majeurs
Dysmorphie( bouche petite, ailes du nez, hypoplasique, oreille mal ourlée)
Cardiopathie conotroncale (qui atteint les voies de chasse du coeur; ex tétralogie de Fallot)
Anomalie palatine (fente ouverte à insuffisance vélo-palatine)
Hypoparathyroidie (baisse de Ca)
Hypoplasie du thymus (déficit immunitaire possible)
Retard psychomoteur (déficience intellectuelle rare; difficultés d’apprentissage fréquent)
Retard de croissance
-Autres signes
Surdité
An. rénales
An. endocriniennes
An. squelettiques
An. oculaires
Psychose (30%)
An. laryngées
syndrome de Digeorges (délétion, incidence, signe majeurs, autres signes)
-Délétion interstitielle de la région 22q11.2
-Incidence 1/4000
•93% survient de novo
•Pour un individu atteint: transmission 50% (la personne transmet soit son chromosome délété ou sont chromosome normal)
-Phénotype très variable (expressivité) même dans une même famille
-Signes majeurs
Dysmorphie( bouche petite, ailes du nez, hypoplasique, oreille mal ourlée)
Cardiopathie conotroncale (qui atteint les voies de chasse du coeur; ex tétralogie de Fallot)
Anomalie palatine (fente ouverte à insuffisance vélo-palatine)
Hypoparathyroidie (baisse de Ca)
Hypoplasie du thymus (déficit immunitaire possible)
Retard psychomoteur (déficience intellectuelle rare; difficultés d’apprentissage fréquent)
Retard de croissance
-Autres signes
Surdité
An. rénales
An. endocriniennes
An. squelettiques
An. oculaires
Psychose (30%)
An. laryngées
les mécanisme de microdélétion récurrente explique quoi?
la fréquence de ces remaniements (fréquence relativement élevée)
le haut taux de survenue de novo (pas hérité de paretns atteint ou porteur
Les points de cassure identiques (sydrome de microdélétion sont des réciproque des syndrome de microduplication et inverse)
syndrome de williams (délétion, incidence, phénotype)
7q11.23
•Incidence env. 1/7500
•Habituellement de novo
•50% de risque de transmission pour les atteints
•Retard mental
•Retard de croissance
•Lèvres proéminentes
•Iris “en étoile”
•Sténose aortique supravalvulaire, sténose pulmonaire
•Hypoplasie de l’émailsyndrome de Prader-willi (région,gène, incidence, cause, phénotype, traitement)
-Région soumise à l’empreinte parentale: 15q11q13
-Incidence: 1/10 000-30 000
-gène SNRPN est exprimé sur la copie paternelle (région sous empreinte parentale)
-causes:
70%: délétion allèle paternel(seule cause diagnostiquée par FISH)
25%: disomie maternelle
2%: empreinte anormale
Gène SNRPN exprimé sur la copie paternelle
-phénotype:
Hypotonie néonatale
Difficultés alimentaires dans la première année de vie (gavage)
Hyperphagie et prise de poids rapide à partir de 1 à 6 ans. Obésité morbide.
Retard de développement et mental
Phénotype: teint pâle, yeux en amande, petits mains et pieds
Hypogonadisme
Complications: diabète, apnées obstructives
-traitement: hormome de croissance, restriction calorique, exercices, réadaptation
syndrome d’angelman
-Région 15q11-13
-Gène UBE3A exprimé à partir de l’allèle maternel
-causes:
70%: délétion allèle maternel (détectable par FISH)
2-5%: disomie paternelle
5%: aN empreinte
20% mutation intragénique
Phénotype:
Retard mental important, ataxie, rires inappropriés
-Incidence: 1/12 000-1/24 000
syndrome d’angelman et syndrome de prader willi différence entre père et mère possible en lab cytogénique
non, le médecin doit faire le diagnostic différentiel cliniquement ou demander un analyse moléculaire pour définir le patron de méthylation (paternel ou maternel) sur le chromosome normal
syndrome de Smith-Magenis
-Délétion interstitielle 17p11.2 3.5Mb
-sx physique
Jeune âge: hypotonie, fentes palpébrales vers le haut
Retard intellectuel
Courte taille, obésité
Mains et pieds petits
1/3 cardiopathie
1/3 aN génitourinaire
l’enfant se réveille beaucoup
-Incidence: 1/25 000
-Habituellement de novo
-Comportement distinctif:
Agression, impulsif, auto-mutilation
Perturbation du sommeil (éveils fréquents durant la nuit, endormissements diurnes)
-Phénotype facial:
Visage rond ou carré
Fentes palpébrales vers le haut
Sourcils épais
Yeux proéminents chez le jeune enfant
Lèvre supérieure charnue, en éversion, philtrum très marqué et grossier, commissures vers le bas
Traits grossiers avec l ’âge
-Traitement: rétablir cycle circadien avec mélatonine et agoniste beta adrénergique
syndrome de microduplication def+En comparaison avec les délétions de ces mêmes régions:
Les réciproques des syndromes de microdélétion. plus difficile de les suspecter cliniquement du a leur phénotype tres variable et généralement peu spécifique
Phénotypes peu distinctifs, moins typés
Phénotypes moins sévères
Plus difficiles à suspecter cliniquement a priori
syndrome de microduplication ex classiques
Dup(22)(q11.2q11.2)
Dup(7)(q11.23q11.23)
Dup(15)(q11q13)
Dup(17)(p11.2p11.2): Potocki-Lupski
15
Peu de malformations
Retard mental et autisme
Convulsions
Diagnostic sur noyaux interphasiques. Difficile sur métaphase
22
Retard mental variable Le plus souvent léger Dysmorphies Cardiopathie aN palatine
7
Retard de langage variable (léger à sévère)
Retard intellectuel d’intensité variable
Troubles autistiques
Malformations congénitales parfois décrites
17
Retard intellectuel
Hypotonie
Trouble autistique
Malformations cardiaques
fish interphasique quand est-il indispensabepour la détection d’anomalies de nombre ou d’anomalie de structure
L’index mitotique est peu élevé (ex cellules néoplasiques)
Un résultat rapide est nécessaire (ex diagnostic prénatal)
Pour un diagnostic d’une mosaïque faible pour une aneuploïdie précise
quel type de sonde peuvent être utilisée dans un fish interphasique
tout sauf peinture et les sondes télométique
avantage de fish
Pas besoin de mitoses donc pas nécessaire d’avoir des cellules en division (pas de culture); l’échantillon peut être traité immédiatement
Un grand nombre de cellules peuvent donc être analysées rapidement
fish trousse commerciales pour diagnostic rapide des aneuploïdies fréquentes (trousses commerciales)
Trousse commerciale avec sondes qui ciblent les chromosomes X, Y, 13, 18 et 21
Résultat 24h plus tard
Utilisé en
prénatal lors de malformations foetales
postnatal lorsque le nouveau-né manifeste des signes de trisomies 13, 18 ou 21
Confirmation par caryotype nécessaire
utilisé en oncologie
oTranslocation 9 entre 22 implique la fusion
des gènes BCR et ABL. elle peut etre invisible au caryotype
Important facteur diagnostique et
pronostique dans les Leucémie Myéloide Chronique et Leucémie Aigue Lymphoblastique
oFISH utilisé sur noyaux interphasiques pour le diagnostic rapide de la fusion des gènes BCR et ABL:
oSans translocation: 2 signaux séparés
oAvec translocation: signaux fusionnés
QfPCR (pour quoi, achronyme, vs fish, fonctionnement)
-Détection rapide des aneuploïdies fréquentes 13, 18, 21, X et Y en prénatal ou à la naissance (similaire à iFISH)
-plus utilisé pour ca que la FISH
-Quantitative fluorescent polymerase chain reaction
-fonctionnement
Amplification de régions précises sur les chromosomes étudiés (3-5 par chromosome)
STR (short tandem repeats)
Permet de distinguer 2 allèles différents par leur taille (migration de 2 pics différents)
Quantification des allèles (hauteur des pics et ratios–>la hauteur du pic est proportionnelle de la qté du nombre d’allèles)
QfPCR avantages
Avantages:
Rapidité (24-48h) comme FISH interphasique
Moins dispendieux que iFISH
QfPCR inconvénients
Désavantages
Moins performant que iFISH pour la détection des mosaïques
Comme iFISH ne détecte pas les anomalies de structure des chromosomes ciblés ou les aneuploïdies des chromosomes non ciblés–>seule réponse–>nombre du chromosome ciblé
Hybridation génomique comparative technique
Comparaison de l’ADN d’un patient avec un ADN contrôle
Cette comparaison s’effectue grâce à l’hybridation de ces ADN marqués en fluorescence (patient + contrôle) sur un support d’ADN
Préparation chromosomique contrôle (lame cytogénétique)
Fragments de l’ADN génomique que l’on veut étudier (micropuce)
Se base sur les mêmes principes d’hybridation (dénaturation et renaturation) de la FISH
Intensité de la fluorescence hybridée sur un segment donné contrôle vs patient évaluée par un ordinateur (les 2 on autant de chance daller shybrider sur une région
autant de fluorescence du patient que du controle=noraml
si il y a une délétion, la région etudier il y va avoir moins que le controle (le controle hybride plus). C’Est le contraire si le ptient a une duplication
–>puis cest traité par une machine un logiciel qui va transposer les intensité de fluorescence–>sur 0 car autant de signaux de fluorescence du patient que du controle mias quand en négatif montre une délétio)
l’hybridation de l’ADN ce fait sur quoi?
Hybridation sur des
séquences d’ADN
fractionnées (sondes) qui
représentent tout le génome
comment comparer
Permet de comparer l’ADN d’un patient à un ADN de référence et de déceler des: Surplus de séquences par rapport à cet ADN de référence: duplication de la séquence pour le patient Pertes de séquences par rapport à cet ADN de référence: délétion pour le patient
Hybridation génomique comparative permet de voir quoi
ca voit juste des délétion et des duplication
ex: trisomie : on va voir surplus dadn sur chromo 21 sur tout le chromo au complet
on voit structure trop petit pour etre vu au caryotype
on regarde tout les chromo en meme temps et donc on ne cible pas une partie comme avec le test fish
Types de micropuce
BACs
-Sondes de la taille d’une sonde de FISH
-Résolution de l’analyse moins grande
Oligonucléotides
Meilleure résolution vs BACs
Sondes oligonucléotides: fragments d’ADN de env 60pb
Oligonucléptides avec ou sans marqueurs SNPs
SNP: single nucleotide polymorphism
Polymorphisme le plus commun du génome humain
Segment d’ADN où les 2 chromosome ne diffèrent que par 1 nucléotide ou paire de base
Permet la détection des disomies uniparentales
Résultat techniquement plus fiable et technique plus rapide
Hybridation génomique sur micropuce avantage
Permet de raffiner l’analyse chromosomique à une résolution de quelques dizaines de kb et donc de poser un diagnostic chez un plus grand nombre de sujets (env. 25%)
Meilleure sensibilité pour la détection de duplication
Allie la précision du FISH et l’approche d’évaluation globale du génome du caryotype
Ne nécessite pas de savoir où cibler dans le génome au préalable
Ne nécessite pas de cellules en division (extraction d’ADN) (peut etre fait pour autopsie)
utile si sx vaste
Remaniements cryptiques et retard mental (lien, ou)
Expliquent un nombre significatif de cas de retard mental
Régions subtélomériques 6%
Régions interstitielles jusqu’à 10%
région subtélomériquesdef/caractéristiques
Régions spécifiques à chacune des régions terminales de chaque bras chromosomique
Riches en gènes
Régions difficiles à distinguer au caryotype standard (zone claires donc difficle de voir différence de taille)
remaniement subtélomérique (chez qui, quoi, test, comment)
Observés chez 6% des enfants avec retard mental, dysmorphies et caryotype normal
Translocations non équilibrés (55%), délétions (39%), duplications (6%)
Hérité d’un remaniement équilibré parental dans env. 40% des cas
Diagnostic années 2000 par FISH, maintenant diagnostiqué par aCGH
Recommandations depuis 2010
L’analyse cytogénétique par micropuce (hybridation génomique sur micropuce, aCGH) est recommandée en première ligne SANS le caryotype
Pour l’investigation des sujets avec
Retard intellectuel, retard de développement
Désordres du spectre de l’autisme
Malformations congénitales, dysmorphies
Syndrome de microdélétion 1p36
Retard mental modéré à sévère Dysmorphies Cardiopathie cardiomyopathie Difficultés alimentaires Convulsions
Microdélétion 17q21.31
Délétion récurrente 478kb-650kb Retard de développement léger à modéré Hypotonie sévère Tempérament amical Difficultés alimentaires Dysmorphies Ventriculomégalie, anomalies de la matière blanche PV
Hybridation génomique sur micropuce
Désavantages:
-Ne permet pas de détecter les remaniements équilibrés (translocations, inversions etc)
-Ne permet pas de “voir” l’organisation cytogénétique du remaniement détecté
-Ne détecte que les anomalies des régions représentées sur la puce (design de la puce)
-Polymorphismes sans conséquence du génome fréquents et parfois n’ont jamais été vus encore dans le laboratoire
La plupart sont rares (retrouvés chez <2% de la population)
Impact sur le phénotype clinique pas toujours clair même pour une anomalie de novo
-Risque de trouver aN pathogénique non reliée (ex gènes cancer, gènes à révélation tardive, porteurs…)
critères de pathogénicité
Taille du remaniement
Survenu de novo
Mais, présence de remaniement de novo chez 1% des contrôles (Science 316:445 (2007))
Type de gènes impliqués et lien avec le phénotype
Remaniement déjà décrit avec phénotype semblable vs région connue comme polymorphique
recommandations pour les test
Utilisation en première ligne de la CGH sur micropuce pour les patients avec
Retard mental, retard de développement
Autisme
Malformations
Utilisation prudente pour malformations foetales
Confirmation des remaniements par caryotype, FISH ou méthodes moléculaires
Conseil génétique pré-test et post-test nécessaire
Non indiqué pour:
Rechercher des remaniements équilibrés (ex translocation)
Si phénotype clair d’anomalie chromosomique précise (ex trisomie 21; S de Williams)
Pour minimiser les défis
Investiguer une personne atteinte
Indication clinique précise nécessaire à l’interprétation des données et donc à fournir au laboratoire
Prélèvement des parents peut être nécessaire à l’interprétation des anomalies retrouvées chez le patient (env 30% des cas)
Bases de données nécessaires pour le suivi des remaniements, des phénotypes et de leur hérédité
Suivi de la littérature
