Cours 4-5 Flashcards
L’absorption d’énergie se fait par des ….?
photons
Qu’est-ce que la lumière?
ensemble de particules qui n’ont pas de masse (photons) mais qui ont une énergie
Qu’est-ce qu’un rayonnement UV-Visible?
l’interaction avec la matière provoque des transitions électroniques (modification de l’arrangement des e¯ de valence)
Qu’est-ce qu’un rayonnement IR?
l’interaction avec la matière provoque des modifications de la position spatiale des atomes autour de leur position d’équilibre par vibration d’élongation et de déformation
Vrai ou Faux
Pour un niveau électronique, il n’existe pas plusieurs niveaux vibrationnels?
Faux, plusieurs niveaux vibrationnels sont divisés en niveaux rotationnels encore plus proches
Comment nomme-t-on les molécules qui absorbent fortement la lumière dans la région des UV et visible?
Chromophores
Plus la molécule a des doubles liaisons, est-ce que l’énergie et la longueur d’onde est plus élevé ou faible?
Plus molécules ont des doubles liaison = plus de conjugaison = plus le niveau d’énergie nécessaire est bas(moins de besoin) et longueur d’onde nécessaire élevé
Le maximum d’absorbance correspond à une longueur d’onde appartenant à quel domaine?
Domaine des ultraviolets (200-400 nm)
Quel est le processus lorsqu’un atome absorbe un photon d’énergie?
Un électron de valence est promu de l’état fondamental à un certain niveau de vibration de l’état excité S1 ou S2
L’absorption de certains composés dépend de quoi?
la température, du pH, de présence de certains solvants
Qu’est-ce que les auxochromes?
Un auxochrome est un groupement d’atomes ionisables pouvant changer l’énergie d’excitation et donc la longueur d’onde d’absorption d’un chromophore.
Quel est le processus de la luminescence?
La luminescence est le phénomène d’émission de photons à partir d’une molécule dans un état électroniquement excité. En retournant à son état fondamental à partir de l’état excité, l’énergie perdue par la molécule se transforme en un photon.
En fonction du processus physique qui a provoqué l’excitation de la molécule, on distingue quels types de luminescence?
*La photoluminescence (fluorescence, phosphorescence): l’énergie provient de l’absorption de photons
*la chimiluminescence : l’énergie est apportée par une réaction chimique exothermique
*la thermoluminescence : l’énergie est apportée par chauffage
*l’électroluminescence : l’énergie provient d’une décharge électrique dans des vapeurs ou des gaz
*la bioluminescence : l’énergie est produite par une réaction enzymatique dans des organismes vivants (bactéries, végétaux et animaux).
Quelle est la fonction des fluorophores?
Les fluorochromes ou fluorophores sont des molécules qui absorbent l’énergie du rayonnement lumineux et leurs électrons passent à des niveaux d’énergie supérieures. Afin de pouvoir retrouver leur niveau normal d’énergie, les électrons vont la restituer sous forme de photons, en émettant une lumière d’une couleur bien précise.
Quel est le type de diagramme qui permet de définir la fluorescence?
Diagramme d’énergie de Jablonski
Vrai ou Faux
Un fluorophore est un chromophore qui réémet un photon absorbé avec une énergie plus élevé?
Faux
Un fluorophore est un chromophore qui réémet un photon absorbé avec une énergie plus faible (λ plus longue)
Le photon de fluorescence émis à une λ plus longue ou plus courte que le photon absorbé?
une λ plus longue
Vrai ou Faux
La molécule peut regagner l’état fondamental à partir du niveau de vibration le plus bas excité.
Faux
La molécule ne peut regagner l’état fondamental qu’à partir du niveau de vibration le plus bas de l’état excité S1
Qu’est-ce qu’un spectre d’excitation?
on fait varier la longueur d’onde d’excitation, et on enregistre l’intensité d’émission à une seule longueur d’onde (habituellement la longueur d’onde de l’intensité d’émission maximale).
Qu’est-ce qu’un spectre d’émission?
on excite avec une longueur d’onde d’excitation, en général la longueur d’onde d’excitation maximale, et on mesure l’intensité de fluorescence aux différentes longueurs d’onde d’émission.
Vrai ou Faux
Les 2 spectres d’excitation et d’émissions sont asymétriques
Faux
Les 2 spectres sont en général symétriques, mais décalés au niveau des longueurs d’onde
Qu’est-ce que le déplacement de stokes?
Chevauchement entre les deux spectres
Vrai ou Faux
La forme du spectre d’émission est indépendante de l’énergie d’excitation
Vrai
La forme du spectre d’émission est indépendante de l’énergie d’excitation (longueur d’onde) à cause de la conversion interne rapide des états excités initiaux supérieurs au niveau d’énergie vibratoire le plus bas de l’état excité de S1.
Vrai ou faux
L’intensité de la lumière émise est proportionnelle à l’énergie requise pour exciter un fluorophore à toute longueur d’onde d’excitation
Vrai
Combien il y a de lamda max pour le spectre d’émission? Et pour le spectre d’excitation?
1 seul pour spectre d’émission et plusieurs pour spectre d’excitation
Vrai ou Faux
Niveaux énergétiques identiques pour le spectre d’émission et spectre d’excitation
Vrai, mais pk?
Quel est le rendement de fluorescence?
c’est le rapport nombre de photons émis / nombre de photons absorbés
Nommez 5 aspects qui influencent la fluorescence
Polarité
Ions
Potentiels électrique
Inhibiteurs
Température
Viscosité
Pression
pH
Liaisons hydrogène
Un bon fluorochrome est une molécule rigide ou molle?
Molécule rigide pour limiter les pertes non radiatives par vibration et rotation
Si la température augmente, quel est l’impact sur la fluorescence?
si la température augmente, les processus non radiatifs liés à l’agitation thermique (collisions intermoléculaires, vibrations et rotations intramoléculaires) augmentent, et le rendement de fluorescence diminue
Si on diminue la viscosité, quel est l’impact sur la fluorescence?
Diminution de fluorescence à cause de la hausse de l’agitation
En phosphorescence , est-ce que les électrons retournent rapidement à leur état fondamental?
Non les électrons ne retournent pas rapidement à leur état fondamental comme la fluorescence
Quelles sont les caractéristiques des Infra-Rouge?
- La spectroscopie IR mesure la fréquence de vibration des liaisons covalentes
- Elle est utilisée pour identifier des groupements fonctionnels (i.e. liaisons chimiques O-H, N-H, C-H etc…)
- L’absorbance suit la loi de Beer- Lambert
- Elle ne dose pas directement un constituant mais quantifie le nombre de liaisons chimiques
- Elle est applicable à n’importe quel type d’échantillon: liquides, solides, gaz, mélanges complexes.
À quoi sert les empreintes infrarouges au contrôle qualité?
Fourni des informations sur la structure et la composition chimique des échantillons étudiés
Comment rendre une protéine d’intérêt invisible, visible?
Étiquetage moléculaire (4 types)
Quel est le principe de l’étiquetage avec un épitope?
Ajout d’un tag constitué d’un codon d’initiation ou stop selon si en N-term ou C-term
Souvent utilisé pour détecter des anticorps
Détecter par immunofluorescence (cellules fixées sur lamelle de verre, protéine d’intérêt avec anticorps et fluorophores)
Quel est le principe de l’addition d’une protéine fluorescente?
Ajout de GFP pour étiquetage moléculaire
Quel est le principe d’un ajout d’enzyme ou tag de fusion pour l’étiquetage moléculaire?
Ajout d’un enzyme qui permet la fluorescence du substrat, cela permet de voir la localisation
Quel est le principe de l’ajout tag tétracystéine pour l’étiquettage moléculaire?
Protéine d’intérêt fusionné génétiquement qui permet de former des complexes et ainsi fluorescé
Doit avoir une molécule organique et protéine fluorescente
Dans un microscope à fluorescence INVERSÉ, est-ce que les objectifs sont sous ou au dessus de la lentille?
Les objectifs sont sous la lentille pour un microscope inversé.
Quelle est la particularité de la microscopie à (épi)fluorescence?
L’échantillon est éclairé par une lumière d’excitation et la lumière émise – la fluorescence – est détectée par le même objectif.
Quelle est la limite de résolution dans un microscope?
Limite de diffraction de la lumière
Quels sont les deux inconvénients de la microscopie à fluorescence?
1- Photoblanchiment
2- Perte de résolution
Qu’est-ce que le principe du photoblanchiment?
Le photoblanchiment est un dommage irréversible du fluorophore suite à une modification covalente induite par les photons en présence d’oxygène (radicaux libres). Solution: agents anti-blachiement qui réduisent la concentration d’O2 et donc la formation de radicaux libres.
Quelle est la cause de la perte de résolution?
Perte de résolution dûe à l’émission de fluorescence défocalisée qui se superpose à l’image du plan focal d’intérêt
Quelles sont les deux façons d’éliminer l’information hors focus?
- Microscopie confocale
- Microscopie multiphotons
Quelle est la grosse particularité de la microscopie confocale?
Grosse différence : Utilisation de laser au lieu de lampe et a un diaphragme d’émission pour bloquer la lumière hors focus
Qu’est-ce que permet le rayon laser lors de la microscopie?
Le rayon laser illumine une partie restreinte du spécimen donc moins de fluorescence défocalisée et donc une meilleure préservation de l’échantillon.
Vrai ou Faux
La microscopie à fluorescence a une meilleure préservation de l’échantillon que la microscopie confocale?
Faux, la microscopie confocale a une meilleure préservation de l’échantillon.
Vrai ou Faux
Est-ce que la microscopie multiphoton a les mêmes avantages que le microscope confocal?
Vrai
Quel type de microscope a la meilleure préservation de l’échantillon puisqu’il est plus focalisé?
Microscopie multiphoton
STED fait partie de quel type de microscope?
Microscopie à fluorescence haute résolution
À quoi sert la microscopie à fluorescence haute résolution?
Très grande résolution permettant de voir toutes les structures internes et externes
Comment faire pour évaluer la mobilité d’une protéine?
Le processus de photoblanchiment permet d’éliminer la fluorescence et selon la diffusion des fluorophores, si les fluorophores vont au spot de photoblanchiment, quelques minutes plus tard et ça ne parait plus, ce qui détermine une protéine mobile.
Quelles applications sont utiles pour voir les protéines en action?
- FISH : voir localisation
- FLIP : mobilité et diffusion
- BiFC: voir interactions
- FRET : spectre d’émission et excitation de la fluorescence
-BRET : interaction substrat et luciférase : meilleure préservation de l’échantillon
Comment définir la densité électronique?
Les atomes et molécules sont définis généralement par la probabilité de trouver un électron dans l’espace
Vrai ou Faux
Est-ce que la cristallographie aux rayons X est utile pour déterminer les structures atomiques?
Vrai
Quel est le premier prix Nobel sur la Cristallographie et quand?
Découverte des rayons X par Rontgen en 1895 – Prix Nobel en 1901
Quel est le dernier prix Nobel sur la Cristallographie et quand?
Structure cristalline d’une RCPG lié à un ligand diffusible par Stevens et Kobilka en 2007 – Prix Nobel en 2012
À quoi sert Protein Data Bank (PDB)?
- Effort pour intégrer et valider les modèles atomiques multidisciplinaires
- Contient plus de 210180 structures déposées (X-ray, NMR and CryoEM)
- 64 000 structures humaines
Vrai ou Faux
La diffraction des rayons X sur un objet moléculaire arrive très souvent
Faux, la diffraction des rayons X sur un objet moléculaire est très rare, la majorité des rayons passent au travers
Est-ce qu’il existe des lentilles pour focuser les rayons X diffractés?
Non
Vrai ou Faux
Est-ce que les photons qui rencontrent des atomes auront des phases différentes après la réflexion?
Vrai, phases différentes suite à la réflexion et un phénomène d’interférence apparaît entre les photons réfléchit d’un cristal, résultant en l’émission d’un patron de diffraction qui dépendra de la position relative des atomes dans le cristal.
Quel type de collection de diffraction peut récolter des cristaux plus petits?
Collection de diffraction en série
Quel type de collection de diffraction a une acquisition des cristaux de façon cryogénique?
Collection de diffraction au synchrotron
Comment fait-on pour faire croitre des cristaux de protéines?
- Pour former des cristaux de protéines, on mélange une protéine concentrée avec une solution de précipitant.
- Le précipitant peut être formé de sels, de solvant et de polymères. Il faut trouver la bonne recette!
- La concentration du précipitant et parfois aussi celle de la protéine est augmentée lentement.
Quelles sont les méthodes de croissance de cristaux?
-Méthodes par diffusion de vapeur -Méthode de lipide en phase cubique (LCP)
-Micro-batch
-Micro-dialyse
-Diffusion à interface libre
-Ensemencement
Qu’est-ce qu’un cristal?
Un cristal est formé par la répétition de cellules unitaires identiques dont les côtés forment un réseau d’arêtes et de sommets
Qu’est-ce qu’un réseaux de Bravais (lattice)?
Un réseau de Bravais est l’agencement d’un système cristallin et positionnement des molécules dans une cellule unitaire.
Une cellule unitaire primitive (P) a combien d’objet par cellule unitaire et ou sont situés ces protéines?
8 protéines sur les sommets
1 objet/cellule unitaire
Une cellule unitaire (I) a combien d’objet par cellule unitaire et ou sont situés ces protéines?
8 protéines sur les sommets + 1 protéine au centre
2 objet/cellule unitaire
Une cellule unitaire (F) a combien d’objet par cellule unitaire et ou sont situés ces protéines?
8 protéines sur les sommets et 8 autres protéines au centre de chaque surface
4 objet/cellule unitaire
Combien il y a de groupes d’espaces possible?
65
Qu’est-ce qu’un groupe d’espace?
La symétrie de la position des protéines dans un cristal est décrite par le groupe d’espace
Quel système cristallins est plus symétrique et lequel le moins symétrique?
+ symétrique : cubique
- symétrique : Triclinic
Nommez un exemple de groupe d’espace
C2
= tourne 180 degré
Comment appelle-t-on tous les points dans un patron de diffraction?
Réflection
Qu’est-ce que l’indice de Miller ?
Méthode décrivant l’orientation d’un plan ou d’un ensemble de plans coupant une cellule unitaire
Que signifie hkl?
h = coupe l’axe des X
k = coupe l’axe des Y
l = coupe l’axe Z ( 0 si en 2D)
Que représente l’indice de Miller?
Décrit la densité électronique
Vrai ou Faux
Plus il y a de réflexions, moins la résolution est bonne?
Faux, plus il y a de réflexions , plus la résolution est meilleure (et mieux sur les bords car plus de diffraction)
Qu’est-ce qu’un facteur de structure?
Réflexion X la phase
Vrai ou Faux
Tous les spots sur un patron de diffraction ont la même phase?
Faux, tous les spots ont une phase différente
Quelles sont les 7 étapes entre la collection de la diffraction et l’assemblage des données?
1- Collection de la diffraction : La plupart du temps sur plusieurs cristaux. Plusieurs ensembles de données.
2- Indexation : Trouver les réflexions dans le signal, attribution des indices de Miller et déterminer le groupe d’espace.
3- Integration: Déterminer l’intensité de chaque réflexion indexée et le bruit de fond. Contrôle de qualité. (fait par logiciel) – éliminer bruits de fond
4- Écaillage (scaling): Assembler les différents ensembles de données en 1 ensemble complet et normaliser le signal (comme des ELISA!).
5- Phasage (phasing): Déterminer un ensemble de phases initiales à attribuer à chaque réflection pour déterminer les facteurs de structure. Plusieurs approches sont possibles. Si des phases sont trouvées, la structure est considérée résolue de manière initiale à cette étape.
6- Raffinement: Processus itératif (bootstrapping) de modification de la structure obtenue dans le but de converger vers les phases réelles.
7- Validation: Est-ce que le modèle est cohérent avec la densité électronique? Est-ce que la géométrie des acide aminés ou autres molécules fait du sens (contrainte chimique) ?
Quelles sont les méthodes de phasage?
1- Méthode directe (pour les petites molécules chimiques) – essayer toutes les phases
2- Remplacement moléculaire (99% du temps)
3- Remplacement isomorphe (isomorphous replacement (SIR, MIR)), utilisation des atomes lourds toxiques
4- Dispersion anormale (anomalous dispersion (SAD, MAD)) utilisation de selenomethionine
Comment fonctionne le remplacement moléculaire?
On connait un indice de Miller pour chaque spot détecté pour notre diffraction, il manque seulement les phases. On connait les phases d’une protéine similaire donc on peut approximer les phases, en faisant une transformé de Fourrier de la protéine connue, et on obtient un patron avec les phases pour chacune des réflexions. Les phases découvertes seront appliquées au patron de diffraction mesuré pour refaire une transformé inverse et mettre notre modèle pour remoduler et recommencer le cycle.
Combien % d’identité faut-il au minimum pour faire un remplacement moléculaire lors du phasage?
40%
Qu’est-ce que le B-factor?
- Le paramètre de déplacement isotropique (B-factor) est une mesure le désordre statique entre atomes équivalents de différentes cellules unitaires et de la vibration dû à la température.
Que signifie l’occupation moléculaire?
- L’occupation (occupancy) est une mesure de la position alternative d’atomes (souvent de chaînes latérales) dans un cristal. Il s’exprime en fraction d’occupation. Par exemple, les atomes d’une chaîne latérale retrouvée dans 2 conformations, 1 chaîne protéique sur 2, possèdent un occupancy de 0.5.
