Cours 1-2-3 Flashcards
Comment s’appelle une molécule organique possédant une base azotée, un phosphate et un ribose?
Nucléotide
Quelles sont les deux techniques de séquençage pour les acides nucléiques?
Séquençage Sanger et Technologie Illumina
Quel est le principe du séquençage Sanger?
Le concept derrière le séquençage de Sanger consiste à effectuer une réaction délongation damorce mais en introduisant une petite quantité de nucléotide terminateur (sans possibilité délongation en 3) couplé à un fluorescent ou radiomarqué. Ceci permet de produire théoriquement toutes les possibilités de longueur dextension dADN. Couplé au pouvoir résolvant de lélectrophorèse ou chromatographie, il est possible de séquencer jusqu à près de 1000 nucléotides consécutifs
Quel est le principe de la technologie Illumina?
Le concept derrière le séquençage développé par la compagnie Illumina consiste à effectuer une réaction délongation damorce mais en introduisant seulement des nucléotides terminateur (sans possibilité délongation en 3) couplé à un fluorescent. A chaque couplage, une lecture est prise et permet ultimement de déterminer la séquence désirée.
Quelle est la direction de la biosynthèse des acides nucléiques?
5’ au 3’
Quelle est la direction de la synthèse chimique?
3’ au 5’
Quelles sont les méthodes de séquençage pour les protéines?
Séquençage d’Edman et spectrométrie de masse
Quel est le principe du séquençage d’Edman?
Plusieurs méthodes pour séquencer les protéines à partir du N ou C-terminal ont été développé mais une des plus populaire demeure le séquençage dEdman. Brièvement, cette technique sappuie sur la réactivité de lamine primaire terminale afin de marquer la protéine en N-terminal, puis cliver le dernier résidue en N-terminal et lidentifier par chromatographie ou électrophorèse. Cette technique à l`avantage de pouvoir être automatisée
Quel est le principe de la spectrométrie de masse?
La spectrométrie de masse offre la possibilité de séquencer des protéines de plus haut poids moléculaires. Dans un premier temps, la protéine dintérêt peut être purifiée sur gel. Ensuite celle-ci est digéré par des protéase qui clive la protéine à des séquences attendus. Le mélange peptidique est ensuite injecté dans le spectromètre de masse. La séquence en acides aminés des peptides est déduite du patron de fragmentation obtenu. Finalement, les séquences peptidiques obtenus sont comparées aux séquences protéiques connus pour ultimement identifier la protéine dintérêt
Quelle est la méthode de séquençage des polysaccharides?
Spectroscopie RMN
Quel est le principe de la spectroscopie RMN?
La spectroscopie RMN permet de déterminer la position relative des protons et carbones dune biomolécule et ultimement, déterminer non seulement la séquence saccharidique mais aussi la structure tertiaire dun polysaccharide.
Quelles sont les deux méthodes de séquençage des lipides?
Spectrométrie de masse et spectroscopie RMN
Qu’est-ce que la chromatographie?
Technique qui permet la séparation de constituants d’une solution via leurs distributions entre deux phases. La phase stationnaire (matrice poreuse, film spécifique) et la phase mobile (liquide) qui ‘passe’ au travers ou dessus la phase stationnaire.
Quels éléments sont importants pour la modulation des séparations?
Nature des interactions : ioniques, affinité, taille
Phase mobile, phase stationnaire
Avantages de la chromatographie à phase liquide?
- Très utilisé dans les laboratoires!
- S’applique à une grande étendue de molécules
- Technique est très versatile
- Facile de combiner diverses colonnes
- Plusieurs équipements à divers prix sont disponibles
Comment fonctionne la chromatographie d’affinité?
Utilise un ligand d’affinité immobilisé sur une colonne (ou un support) : Ce ligand possède une forte affinité et une grande spécificité pour une substance biologique. Le ligand lie la substance à purifier, malgré la présence de beaucoup d’autres composés dans la solution.
Souvent utilisée en mode ‘batch’ purification : Purie sur un support fixe et on élue les molécules isolées en une seule étape
Plusieurs lavages
Quels sont les types de molécules?
- Anticorps - Ligands : Protéine G, protéine A
- Protéines de fusion - Ligands: Glutathion (GST), amylose (MBP), chelator métallique (6x Histidine), GFP-Trap (GFP).
- Protéases - Benzamidine (Facteur Xa, thrombine)
- Acides Nucléiques - ARN et protéines associées (MS2-tag)
- Protéines - Utilise des anticorps ou ‘nanobodies’ spécifiques
Nanobodies : Anticorps de Lama : Le domaine de reconnaissance est sur une seule molécule, donc il est simple de l’isoler et de lier à un support spécifique
Comment fonctionne la chromatographie d’échangeurs ioniques?
Chromatographie ou des ions qui sont électrostatiquement associés à une matrice insoluble sont réversiblement remplacés par des ions en solution.
* Permet de séparer des protéines en fonction de leurs charges.
* Majoritairement en modulant la concentration des ions dans la phase mobile.
* Peut être fait également en variant le pH de la phase mobile.
* Ne permet pas d’isoler des protéines uniques, mais plus une gamme de protéines ayant une charge similaire.
Souvent couplé pour isoler les composantes recherchées
Comment fonctionne la chromatographie liquide d’exclusion (gel filtration)?
Technique de chromatographie dans laquelle les molécules sont séparées en fonction de leurs tailles.
Donc, la phase solide de ce type de chromatographie correspond à des billes d’un matériel poreux ressemblant à une éponge possédant des pores d’une taille connue.
Permet d’estimer des tailles moléculaires et ce, dans des échantillons complexes
Peut se faire sur FPLC
- Les très grosses molécules ne peuvent pas pénétrer dans la matrice, donc elles éluent en premier
- Les petites molécules pénètrent et sont retardées par la matrice
- Plusieurs types de matrice avec des pores différents existent.
À quoi sert la chromatographie sur papier?
Vieille technique, moins utilisée de nos jours.
* Par-contre, elle peut toujours permettre de résoudre/quantifier des molécules difficiles à quantifier autrement
* Solvant est souvent un mix de solvant aqueux et organique: eau/butanol/acide acétique
* Se fait également sur une plaque de verre (Thin Layer Chromatography - TLC)
* Permet la séparation de divers acides aminés et leur quantification
À quoi sert l’électrophorèse ?
Migration d’ions dans un champ électrique
Quels aspects régulent la grosseur des pores?
1) la concentration de monomère totale (générale 15%)
2) % du crosslinker (19:1 versus 29:1 , plus de linker dans le 19:1 donc plus serré les pores)
Quelles sont les spécificités de l’électrophorèse native?
- Les protéines se déplacent en fonction de : Taille, Statut oligomérique (complexe protéique) , Forme, Charge
- Activités des protéines demeurent intactes
- Plus difficile d’analyser des complexes (très haut)
Nommez un désavantage d’un gel natif standard
La mobilité des protéines dépend de leurs charges.
Quel colorant est utilisé pour le Blue-Native Page et quel est son désavantage?
Bleu de coomasie pour donner une charge uniforme aux protéines mais peut agir comme détergent et briser des interactions faible, donc moins bonne résolution du gel.
À quoi sert le SDS dans un SDS-Page?
- Dénature les protéines
- Ajoute une charge négative pour la migration (1.4g SDS/g prot.)
- Ajoute fréquemment agent dénaturant dans le ‘tampon de chargement’ pour dénaturer les ponts disulfures.
Vrai ou Faux
Il est nécessaire d’utiliser un gel concentré lors d’un SDS page?
Vrai
Avec une concentration en acrylamide plus faible (4%) et un pH plus faible, il permet de concentrer toutes les protéines à l’interface et sépare les protéines en fonction de leur taille.
Nommez 5 paramètres à optimiser pour les immunobuvardages
1) Séparation et quantité optimale des protéines
2) Transfert adéquat et uniforme des protéines
3) Dilution des Acs primaire et secondaire
4) Utilisation adéquate de l’ECL
5) Exposition appropriée de l’IB
Vrai ou Faux
Les gels d’acrylamide peuvent séparer des molécules d’ADN et d’ARN
Vrai
Quelle est l’intervalle de la concentration habituelle pour le gel d’agarose?
Entre 0,7% et 2.5%
Un gel d’agarose standard a une résolution de combien de kb? et quelle est la méthode pour résoudre des plus gros fragments?
Standard entre 15-30 kb
Pour de plus gros fragments, il y a l’électrophorèse par champs pulsés : courant envoyé avec 3 angles à différents moments
Le northern est fait pour dénaturé l’ARN ou l’ADN?
L’ARN
Le southern blots est fait pour l’ADN ou l’ARN?
L’ADN
