Cours 1-2-3

Question 1

Comment s’appelle une molécule organique possédant une base azotée, un phosphate et un ribose?

Answer 1

Nucléotide

Question 2

Quelles sont les deux techniques de séquençage pour les acides nucléiques?

Answer 2

Séquençage Sanger et Technologie Illumina

Question 3

Quel est le principe du séquençage Sanger?

Answer 3

Le concept derrière le séquençage de Sanger consiste à effectuer une réaction délongation damorce mais en introduisant une petite quantité de nucléotide terminateur (sans possibilité délongation en 3) couplé à un fluorescent ou radiomarqué. Ceci permet de produire théoriquement toutes les possibilités de longueur dextension dADN. Couplé au pouvoir résolvant de lélectrophorèse ou chromatographie, il est possible de séquencer jusqu à près de 1000 nucléotides consécutifs

Question 4

Quel est le principe de la technologie Illumina?

Answer 4

Le concept derrière le séquençage développé par la compagnie Illumina consiste à effectuer une réaction délongation damorce mais en introduisant seulement des nucléotides terminateur (sans possibilité délongation en 3) couplé à un fluorescent. A chaque couplage, une lecture est prise et permet ultimement de déterminer la séquence désirée.

Question 5

Quelle est la direction de la biosynthèse des acides nucléiques?

Answer 5

5’ au 3’

Question 6

Quelle est la direction de la synthèse chimique?

Answer 6

3’ au 5’

Question 7

Quelles sont les méthodes de séquençage pour les protéines?

Answer 7

Séquençage d’Edman et spectrométrie de masse

Question 8

Quel est le principe du séquençage d’Edman?

Answer 8

Plusieurs méthodes pour séquencer les protéines à partir du N ou C-terminal ont été développé mais une des plus populaire demeure le séquençage dEdman. Brièvement, cette technique sappuie sur la réactivité de lamine primaire terminale afin de marquer la protéine en N-terminal, puis cliver le dernier résidue en N-terminal et lidentifier par chromatographie ou électrophorèse. Cette technique à l`avantage de pouvoir être automatisée

Question 9

Quel est le principe de la spectrométrie de masse?

Answer 9

La spectrométrie de masse offre la possibilité de séquencer des protéines de plus haut poids moléculaires. Dans un premier temps, la protéine dintérêt peut être purifiée sur gel. Ensuite celle-ci est digéré par des protéase qui clive la protéine à des séquences attendus. Le mélange peptidique est ensuite injecté dans le spectromètre de masse. La séquence en acides aminés des peptides est déduite du patron de fragmentation obtenu. Finalement, les séquences peptidiques obtenus sont comparées aux séquences protéiques connus pour ultimement identifier la protéine dintérêt

Question 10

Quelle est la méthode de séquençage des polysaccharides?

Answer 10

Spectroscopie RMN

Question 11

Quel est le principe de la spectroscopie RMN?

Answer 11

La spectroscopie RMN permet de déterminer la position relative des protons et carbones dune biomolécule et ultimement, déterminer non seulement la séquence saccharidique mais aussi la structure tertiaire dun polysaccharide.

Question 12

Quelles sont les deux méthodes de séquençage des lipides?

Answer 12

Spectrométrie de masse et spectroscopie RMN

Question 13

Qu’est-ce que la chromatographie?

Answer 13

Technique qui permet la séparation de constituants d’une solution via leurs distributions entre deux phases. La phase stationnaire (matrice poreuse, film spécifique) et la phase mobile (liquide) qui ‘passe’ au travers ou dessus la phase stationnaire.

Question 14

Quels éléments sont importants pour la modulation des séparations?

Answer 14

Nature des interactions : ioniques, affinité, taille
Phase mobile, phase stationnaire

Question 15

Avantages de la chromatographie à phase liquide?

Answer 15

• Très utilisé dans les laboratoires!
• S’applique à une grande étendue de molécules
• Technique est très versatile
• Facile de combiner diverses colonnes
• Plusieurs équipements à divers prix sont disponibles

Question 16

Comment fonctionne la chromatographie d’affinité?

Answer 16

Utilise un ligand d’affinité immobilisé sur une colonne (ou un support) : Ce ligand possède une forte affinité et une grande spécificité pour une substance biologique. Le ligand lie la substance à purifier, malgré la présence de beaucoup d’autres composés dans la solution.
Souvent utilisée en mode ‘batch’ purification : Purie sur un support fixe et on élue les molécules isolées en une seule étape
Plusieurs lavages

Question 17

Quels sont les types de molécules?

Answer 17

• Anticorps - Ligands : Protéine G, protéine A
• Protéines de fusion - Ligands: Glutathion (GST), amylose (MBP), chelator métallique (6x Histidine), GFP-Trap (GFP).
• Protéases - Benzamidine (Facteur Xa, thrombine)
• Acides Nucléiques - ARN et protéines associées (MS2-tag)
• Protéines - Utilise des anticorps ou ‘nanobodies’ spécifiques
  Nanobodies : Anticorps de Lama : Le domaine de reconnaissance est sur une seule molécule, donc il est simple de l’isoler et de lier à un support spécifique

Question 18

Comment fonctionne la chromatographie d’échangeurs ioniques?

Answer 18

Chromatographie ou des ions qui sont électrostatiquement associés à une matrice insoluble sont réversiblement remplacés par des ions en solution.
* Permet de séparer des protéines en fonction de leurs charges.
* Majoritairement en modulant la concentration des ions dans la phase mobile.
* Peut être fait également en variant le pH de la phase mobile.
* Ne permet pas d’isoler des protéines uniques, mais plus une gamme de protéines ayant une charge similaire.
Souvent couplé pour isoler les composantes recherchées

Question 19

Comment fonctionne la chromatographie liquide d’exclusion (gel filtration)?

Answer 19

Technique de chromatographie dans laquelle les molécules sont séparées en fonction de leurs tailles.
Donc, la phase solide de ce type de chromatographie correspond à des billes d’un matériel poreux ressemblant à une éponge possédant des pores d’une taille connue.
Permet d’estimer des tailles moléculaires et ce, dans des échantillons complexes
Peut se faire sur FPLC

• Les très grosses molécules ne peuvent pas pénétrer dans la matrice, donc elles éluent en premier
• Les petites molécules pénètrent et sont retardées par la matrice
• Plusieurs types de matrice avec des pores différents existent.

Question 20

À quoi sert la chromatographie sur papier?

Answer 20

Vieille technique, moins utilisée de nos jours.
* Par-contre, elle peut toujours permettre de résoudre/quantifier des molécules difficiles à quantifier autrement
* Solvant est souvent un mix de solvant aqueux et organique: eau/butanol/acide acétique
* Se fait également sur une plaque de verre (Thin Layer Chromatography - TLC)
* Permet la séparation de divers acides aminés et leur quantification

Question 21

À quoi sert l’électrophorèse ?

Answer 21

Migration d’ions dans un champ électrique

Question 22

Quels aspects régulent la grosseur des pores?

Answer 22

1) la concentration de monomère totale (générale 15%)
2) % du crosslinker (19:1 versus 29:1 , plus de linker dans le 19:1 donc plus serré les pores)

Question 23

Quelles sont les spécificités de l’électrophorèse native?

Answer 23

1. Les protéines se déplacent en fonction de : Taille, Statut oligomérique (complexe protéique) , Forme, Charge
2. Activités des protéines demeurent intactes
3. Plus difficile d’analyser des complexes (très haut)

Question 24

Nommez un désavantage d’un gel natif standard

Answer 24

La mobilité des protéines dépend de leurs charges.

Question 25

Quel colorant est utilisé pour le Blue-Native Page et quel est son désavantage?

Answer 25

Bleu de coomasie pour donner une charge uniforme aux protéines mais peut agir comme détergent et briser des interactions faible, donc moins bonne résolution du gel.

Question 26

À quoi sert le SDS dans un SDS-Page?

Answer 26

• Dénature les protéines
• Ajoute une charge négative pour la migration (1.4g SDS/g prot.)
• Ajoute fréquemment agent dénaturant dans le ‘tampon de chargement’ pour dénaturer les ponts disulfures.

Question 27

Vrai ou Faux
Il est nécessaire d’utiliser un gel concentré lors d’un SDS page?

Answer 27

Vrai
Avec une concentration en acrylamide plus faible (4%) et un pH plus faible, il permet de concentrer toutes les protéines à l’interface et sépare les protéines en fonction de leur taille.

Question 28

Nommez 5 paramètres à optimiser pour les immunobuvardages

Answer 28

1) Séparation et quantité optimale des protéines
2) Transfert adéquat et uniforme des protéines
3) Dilution des Acs primaire et secondaire
4) Utilisation adéquate de l’ECL
5) Exposition appropriée de l’IB

Question 29

Vrai ou Faux
Les gels d’acrylamide peuvent séparer des molécules d’ADN et d’ARN

Answer 29

Vrai

Question 30

Quelle est l’intervalle de la concentration habituelle pour le gel d’agarose?

Answer 30

Entre 0,7% et 2.5%

Question 31

Un gel d’agarose standard a une résolution de combien de kb? et quelle est la méthode pour résoudre des plus gros fragments?

Answer 31

Standard entre 15-30 kb
Pour de plus gros fragments, il y a l’électrophorèse par champs pulsés : courant envoyé avec 3 angles à différents moments

Question 32

Le northern est fait pour dénaturé l’ARN ou l’ADN?

Answer 32

L’ARN

Question 33

Le southern blots est fait pour l’ADN ou l’ARN?

Answer 33

L’ADN