cours 3 (jim) Flashcards
quels sont les facteurs importants pour l’expression et la purification des protéines ?
- sources de la protéine
- la pureté et quantité nécessaire
- le type d’expérience
quel est le niveau de pureté pour l’étude d’activités ?
80-90% pureté
quel est le niveau de pureté pour l’étude de structures ?
≥ 95% pureté
quel est le niveau de pureté pour l’application industrielle ?
pureté variable
quel est le niveau de pureté pour l’application thérapeutique ?
≥ 99% pureté
quels sont les facteurs spécifiques d’une protéine qui influencent son expression et sa purification ?
- la localisation dans la cellule
- les caractéristiques physico-chimique de la protéine
quels sont les localisations possibles de la protéine dans la cellule ?
- membrane
- noyau
- cytoplasme
- réticulum endoplasmique
quels sont les caractéristiques physico-chimiques de la protéine ?
- la taille moléculaire
- le p.i
- la glycosylation, phosphorylation et méthylation
- la liaison avec le métal ou ligand
quels sont les sources de protéines les plus communes ?
- tissus animaux
- bactéries: E.coli
- levures
- cellules d’insectes
- cellules humaines
quels sont les étapes pour l’isolation de protéines de tissus animaux ?
- localiser une source
- prélever l’organe optimal
- homogénéiser les tissus
- purifier la protéine
quels sont les avantages de l’isolation de protéines de tissus animaux ?
- protéines natives
- ont des modifications post-traductionnelles
- pas cher (c’est freeeee)
quels sont les limites de l’isolation de protéines de tissus animaux ?
- sources limitées
- petites quantités de protéines spécifiques
- pas d’étiquette
comment se déroule l’expression de protéines dans la bactérie ?
- construire un vecteur
- sélection avec un antibiotique
- cultivé les bactéries, puis induire la protéine à l’IPTG
- purifier et analyser
quels sont les avantages de faire l’expression des protéines dans la bactérie ?
- bcp de protéines et milieux pas cher
- rapide culture et expression
- bcp de vecteurs d’expression différents
- l’expression de protéines marquées est facile avec des souches bactériennes auxotrophes
quels sont les limites de faire l’expression des protéines dans la bactérie ?
- absence de modifications post-traductionnelles ou ponts disulfures
- not good pour les protéines membranaires
- différents codons chez la bactérie
quelles solutions existent pour gérer les différences de codons chez la bactérie ?
- synthèse de gènes avec optimisation de codons pour les bactéries
- bactéries avec surexpression des ARNt pour les codons rares
quelles sont les grandes étapes de l’expression des protéines dans la levure ?
- construire un vecteur
- faire la sélection avec les a.a
- cultiver et induire au MeOH
- purifier et analyser
quels sont les avantages de l’expression des protéines dans la levure ?
- bcp de protéines et milieux pas chers
- ponts disulfures et certaines modifications post-
traductionnelles (phosphorylation) - l’expression de protéines marquées est possible (RMN)
quels sont les limites de l’expression des protéines dans la levure ?
- moins rapide que la bactérie
- différent codons chez la levure
- pas bonne pour les protéines glycosylées
quelles sont les grandes étapes de l’expression des protéines dans ls insectes ?
- mettre le gène dans un pFastBac
- insérer dans un bacmid
- sélection des bacmid ayant le gène par antibiotique
- extraction de l’ADN recombinant
- infection des SF9
- purifier et analyser
quels sont les avantages de l’expression des protéines chez les insectes ?
- ponts disulfures et modifications post traductionnelles
- très bon pour les protéines glycosylées
- vecteurs avec His-tag et GST-tag
- meilleures codons- bon pour les grosses protéines humaines
quels sont les limites de l’expression des protéines chez les insectes ?
- pas rapide (1-2 semaines) et moins de protéine
- milieux spéciaux (Plus chers)
- production de protéines marquées est difficile
comment se produit l’expression dans les cellules humaines ?
- construction d’un vecteur pTT
- amplification du plasmide dans une bactérie
- cultiver et transfection de cellule (HEK293)
- purification et analyse
quels sont les avantages du vecteur pTT ?
- pour expression intracellulaire ou sécrétion extracellulaire
- jusqu’à 10 fois plus efficace que pCDNA
- possibilité de produire entre 20 à 60 mg de protéine recombinante par litre
- protéines avec les His-TAG
quels sont les avantages d’utiliser les cellules HEK293-E6 ?
- aucun problème de codon rare
- surexpression des chaperons
- croissance en suspension = Possibilité de densité cellulaire plus élevée
quels sont les avantages de l’expression dans les cellules humaines ?
- ponts disulfures, modifications post-traductionnelles et protéines membranaires
- protéines contaminantes ne sont pas immunogènes
- vecteurs production avec His-tag
- codons parfaits- meilleur choix pour les très grosses protéines humaine
quelles sont les limites de l’expression dans les cellules humaines ?
- pas rapide et moins de protéines
- besoins d’un fermenteur
- milieux spéciaux (très cher)
- production de protéines marquées impossible
quelles sont les méthodes de choix pour:
les petites protéines ?
bactéries
quelles sont les méthodes de choix pour:
les petites protéines avec des ponts S-S
levure
quelles sont les méthodes de choix pour:
les protéines membranaires ?
Sf9 ou HEK293
quelles sont les méthodes de choix pour:
les grosses protéines humaines ?
Sf9 ou HEK293
quelles sont les méthodes de choix pour:
les protéines marquées ?
bactéries ou levures
quelles sont les méthodes de choix pour:
les applications thérapeutiques ?
HEK293
quel est le schéma de purification ?
- suspendre et lyser les cellules, puis centrifugation
- surnageants + culots
DANS LE SURNAGEANT
1. centrifuger
2. obtention de protéines solubles, donc purification illimitée
DANS LE CULOT
1. lavage avec détergent, puis centrifugation
2. obtention de corps d’inclusions
3. solubilisation avec des agents chaotropiques
4. purification limitée
5. renaturation et essais biologiques
quelle est la stratégie de purification en 3 étapes des protéines solubles ?
Première étape: Capturer
-isoler et concentrer
1. Précipitation saline
2. La chromatographie d’affinité
3. La chromatographie par échange d’ions
Deuxième étape: Purifier
-retirer grosses impuretés
1. La chromatographie d’affinité
2. La chromatographie par échange d’ions
Troisième étape: Polir
- retirer petites impuretés
1. La chromatographie par filtration sur gel
2. La chromatographie en phase inverse
quelle est la stratégie de purification en 2 étapes des corps d’inclusions ?
- Suspendre corps d’inclusion avec urée (8M) ou guanidinium (6M), puis centrifuger
- surnageant +culots
PRENDRE LE SURNAGEANT
purifier:
Chromatographie en Urée:
1. La chromatographie par échange d’ions
2. La chromatographie d’affinité- His-tag
3. La chromatographie par filtration sur gel
Chromatographie en Guanidinium:
1. La chromatographie d’affinité- His-tag
2. La chromatographie par filtration sur gel
- renaturation avec le tampon physiologique
- essais biologiques
quels sont les agents chaotropiques ?
guanidium
urée
quel est le pH des tampons pour la purification ?
6.0 - 9.0
quels sont les tampons pour faire une purification ?
- Tris-HCl
- Phosphate
- HEPES
quels sont les sels pour les tampons pour la purification ?
NaCl, KCl
quels sont les dénaturants pour les tampons pour la purification ?
urée
guanidium
quels sont les inhibiteurs de protéases pour la purification ?
mélange (stabilité)
quels sont les antioxydants pour la purification ?
DTT (dithiothéitol), BME (b-mercaptoéthanol)
quelles sont les étapes de la procédure générale pour la précipitation saline ?
1) Commence avec la fraction soluble
2) Augmente la concentration de sulfate d’ammonium
de 10% à la fois
3) Centrifuger et resurprendre le culot pour analyse
4) Répéter les étapes 2 et 3 jusqu’à 80- 90% sulfate
d’ammonium
5) Electrophorèse pour identifier les culots avec la protéine
6) Re suspendre les culots avec la protéine dans le tampon original pour purification additionnelle
quels sont les types de chromatographies ?
FPLC et HPLC
quels sont les caractéristique du FPLC ?
- pression moyenne
- débit faible à rapide
- tube de PEEK
quels sont les caractéristique du HPLC ?
- pression haute
- débit très faible à rapide
- tube d’acier ou de titane
quels sont les caratéristiques de l’élution linéaire ?
Élution linéaire: Un tampon (Tampon A)
* Le protocole est plus facile
* L’équipement est moins cher
* La séparation est moins efficace
quels sont les caratéristiques de l’élution par gradient ?
Élution par gradient: Deux tampons ou plus
* Le protocole est plus compliqué
* L’équipement est plus cher
* La séparation est plus efficace
comment se fait la détection du signal ?
Détection aux ultraviolets (UV)
qui absorbent dans l’ultraviolet en bas de 250 nm ?
- le groupe amide
- certains groupes fonctionnels des chaînes latérales
qui absorbent dans l’ultraviolet au dessus de 250 nm ?
acides aminés aromatiques
quels sont les filtres UV les plus importants pour des protéines ?
- 214 nm ou 228nm
- 254 nm
- 280 nm
quelles sont les caractéristiques des filtres 214 nm ou 228nm ?
- le plus sensible
- détecte le lien amide de tous les acides aminés
quelles sont les caractéristiques des filtres 254 nm ?
- le moins sensible
- détecte seulement le noyau aromatique de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane
quelles sont les caractéristiques des filtres 280 nm ?
- détecte seulement le noyau aromatique de la
tyrosine et du tryptophane
pour quoi la chromatographie d’affinité est une bonne méthode ?
pour les 2 premières étapes de purifications
Première étape: Capturer
-isoler et concentrer.
Deuxième étape: Purifier
-retirer grosses impuretés
quel est le principe de base de la chromatographie d’affinité ?
une liaison spécifique entre une protéine et une résine qui est facilement réversible
quels sont les 2 exemples de la chromatographie d’affinité ?
- des protéines natives avec une propriété biochimique unique pour un ligand
- des protéines de fusion qui forment une liaison avec un ligand
exemples de protéines natives :
enzymes avec cofacteur NADP+
protéine de liaison avec l ’ATP
protéine de liaison avec l ’GTP
protéine de liaison avec le métal
nomme-moi des protéines de fusions
- Glutathion-S-transférase (GST)
- Attache-(His)6
- Protéine de liaison au maltose
quel est le rôle du bras espaceur ?
de minimiser la liaison avec la matrice et les protéines
que retrouve-t-on dans l’ARNm de la protéines de fusion GST ?
- promoteur
- GST
- site de coupure de la protéase
- gène X
quelles sont les avantages de la fusion de la GST ?
- augmente la solubilité de la protéine
-purification facile avec résine glutathion - élution facile avec un petit ligand (glutathion)
quelles sont les désavantages de la fusion de la GST ?
- Une grosse étiquette/tag (~250 acides aminés, 26 kDa)
- peut pas purifier avec dénaturants
- GST forme un dimère. Pas bon pour les essais
biologiques
quels sont les 3 protéases les plus populaires ?
- la thrombine
- le facteur Xa
- la TEV
quel est le compétiteur de la protéine de la fusion polyhistidine ?
imidazole
quels sont les avantages de la fusion poly-histidine ?
- purification facile avec résine de nickel
- élution facile avec un petit ligand (imidazole)
- purification possible avec détergents et dénaturants
- une petite étiquette/tag (6 acides aminés)
quels sont les désavantages de la fusion de poly-histidine ?
- augmente la formation de corps d’inclusion
- purification n’est pas possible avec antioxydants comme DTT
- pas bon pour purifier des protéines qui lient des métaux de transition
quelles sont les propriétés essentielles pour le compétiteur ?
- faire une liaison spécifique et facilement réversible
- être stable chimiquement et inerte (pas réactif)
- pas trop cher
- être de petite taille moléculaire: Séparation par dialyse après la purification
quelle est la différence entre les compétiteurs suivants: imidazole et glutathione
imidazole: se lie au Nickel attaché à la résine
glutathione: se lie au GST-protéines
