Cours 2 : Microscopie de Fluorescence & Bi-photonique & Raman & SERS

Question 1

citez 3 colorants et leurs couleurs du noyau?

Answer 1

DAPI => couleur bleu absorption dans uv à 300 nm
PI => Emission rouge après excitation UV (305nm) ou excitation verte
(538nm)
BET=>Emission rouge-orangée après excitation UV

Question 2

L’intensité de Fluorescence détectée 𝑰𝒇𝒍 dépend de ? donnez sa loi

Answer 2

• la concentration de molécules
• l’intensité d’excitation
• épaisseur de l’échantillon à parcourir
• probabilité d’interaction défini par la section efficace 𝜎.
  𝐼𝑓𝑙 = 𝛼𝑙𝜎𝐼𝑒𝑥𝐶
  𝛼 est une constante de proportionnalité

Question 3

• citez un exemple de biocapteur par fluorescence?

Answer 3

détection de métaux lourds hg++ par adn multithymine

• un brin est fixe non fluorescent
• un brin ext libre + fluorophores

Question 4

qu’est ce qui limite la résolution axiale de la microscopie optique?
donnez la loi de calcul de la résolution de la psf?
donnez la loi de la résolution?
la profondeure du champ de la psf ou résolution axiale de psf?

Answer 4

diffraction sur l’objectif,
une image appelée disque d’Airy dont le diamètre 𝑤𝑥𝑦 est donné par :
𝑤𝑥𝑦 = 1,22𝜆𝑒𝑥/𝑁𝐴
d𝑥𝑦 = 0,61 𝜆𝑒𝑥/𝑁𝐴
𝑤𝑧 =4𝜆𝑒𝑥/𝑁𝐴²

Question 5

quelle type de résolution améliore la microscopie confocale?

Answer 5

elle améliore la résolution axiale

Question 6

qu’est ce que la section efficase de la fluorescence?

Answer 6

probabilité d’interaction d’une particule.

photon et molécule

Question 7

quelle est la limitation majeur de la fluo bi-photonique?

Answer 7

faible section efficace.

mais on utilisa un laser pulsé => doc faut qu’il soit performant.

Question 8

donnez la loi de la fréquence de fluorescence par un laser pulsé d’une microscopie bi-photonique?

Answer 8

Fimpulsion = 1/2 δ 1/(r ζ) I²moyenne

Question 9

sur quoi est basé la spectro raman ?

Answer 9

La spectrométrie Raman est une technique optique basée sur le
phénomène de diffusion inélastique de la lumière.

Question 10

pourquoi l’anti-Stokes est moins probable que la Stokes ?

Answer 10

Population des niveaux de vibration (MaxwellBoltzmann):

𝑁𝑖/𝑁0

Question 11

diffusion stokes?

anti-stokes?

Answer 11

• Pour la diffusion Stokes, l’état final après désexcitation est un niveau vibrationnel plus excité que l’état initial.
• Pour la diffusion anti-Stokes, le système est au départ dans un niveau vibrationnel excité et l’état final après désexcitation est dans un état moins énergétique.

Question 12

de quels paramétres dépend l’intensité du signal Raman?

donnez la loi de l’intensité du signale Raman?

Answer 12

• intensité du ray incident
• concentration des molécules
• section efficace
  𝐼𝑠 = 𝜎𝑠𝐼𝑒𝑥𝑁

Question 13

quelle est la limitation majeure de la technque Raman?

Answer 13

la faible intensité des signaux dus à la diffusion Raman (à cause de la très faibles
sections efficaces de diffusion), peut limiter l’utilisation de cette technique dans le
cas de très faibles concentrations d’espèces diffusantes

Question 14

comment palier à la limitation Raman?

expliquez le concept?

Answer 14

Un moyen pour pallier à cette carence est l’effet SERS (Surface Enhanced Raman
Scattering), c’est-à-dire, l’exaltation de surface de la diffusion Raman.
• L’effet SERS apparaît lorsque les molécules de l’espèce à détecter sont adsorbées à
la surface d’un substrat nanostructuré d’un métal noble (or ou argent, le plus
souvent).
• Ce substrat, qui va être excité dans sa résonance plasmon par l’onde incidente, va
exalter l’intensité de diffusion Raman de la molécule et donc baisser très
significativement sa limite de détection. Des études sur des molécules uniques ont
ainsi été réalisées.

Question 15

qu’est ce que le plasmon de surface?

quelle est le paramétre qui l’affecte chez les nanoparticuels métaiques?

Answer 15

• Oscillation du nuage électronique (dipôles) au passage de l’onde Electromagnétique.
• la taille

Question 16

définir le plasmon de surface ? de quoi il dépend?

Answer 16

Les métaux nobles possèdent deux types d’électrons, les électrons de valence et les électrons de conduction. Dans les domaines de fréquence du visible et du proche infrarouge, les électrons de conduction des métaux nobles peuvent être considérés comme quasi libres et donc indépendants du noyau atomique. Les électrons de conduction forment alors un gaz d’électrons délocalisés dans le métal. Sous l’effet d’un rayonnement électromagnétique, les électrons oscillent autour de leur position d’équilibre et génèrent une polarisation locale du métal.
Ces ondes, couplées au déplacement des électrons, ont une amplitude maximale à une
fréquence de résonance particulière qui correspond à la fréquence propre d’oscillation du gaz d’électrons (ou plasma). La dissipation est alors maximale et l’onde est très fortement
absorbée. Ce phénomène est utilisé principalement en biologie pour la détection de marqueurs adsorbés sur une surface fonctionnalisée.
Les nanoparticules métalliques peuvent également être le siège d’oscillations de type plasmon. Dans ce cas, les oscillations ne se propagent pas mais restent localisées sur la
particule, on parle de plasmon de surface localisé. La fréquence de résonance plasmon est déterminée par la force de rappel des électrons de conduction du métal, laquelle dépend d’un grand nombre de paramètres tels que la composition, la taille et la forme des nanoparticules métalliques, ainsi que leur environnement chimique.

Question 17

• donnez la loi du champ induit à l’intérieir de la particules ?
• donnez la loi du Champ induit à l’extérieur de la nanoparticule 𝐸𝑒𝑥𝑡 ?

Answer 17

𝐸𝑖𝑛𝑡 = (3𝜀𝑑/ (𝜀𝑚 + 2𝜀𝑑)) 𝐸0
𝐸𝑒𝑥𝑡 = 𝐸0 + 𝑎^3 (𝜀𝑚 − 𝜀𝑑/𝜀𝑚 + 2𝜀𝑑) (3𝑛( 𝑛 ∙ 𝐸0) − 𝐸0)/𝑟^3

Question 18

quend est ce que l’inetnsité du champ electrique est elle maximale?

Answer 18

L’intensité du champ électrique induit est
maximale lorsque 𝜀𝑚 + 2𝜀𝑑 est minimale:
lorsque la fonction diélectrique complexe
satisfait la condition de Frölich :
𝑅𝑒 𝜀𝑚 = −2𝜀d

Question 19

loi du facteur d’amplification de l’intensité?

Answer 19

𝑀𝑙𝑜𝑐 (𝜔𝐿) = |𝐸𝑙𝑜𝑐 𝜔𝐿|²/ |𝐸0|²

Question 20

loi du gain SERS ou exaltation du signal?

Answer 20

sers = (𝑀𝑙𝑜𝑐 (𝜔𝐿))² = |𝐸𝑙𝑜𝑐 𝜔𝐿|^4/ |𝐸0|^4

Question 21

donnez la loi de l’intensité du signal Raman et celle de l’intensité du signal SERS?

Answer 21

Is = 𝜎𝑠𝑁𝐼𝑒x  
Isers = 𝜎𝑠𝑁𝐼𝑒x M²

Question 22

donnez un exemple de biocapteur en biologie par SERS?

Answer 22

biocapteur antidopage. par détection de la molécule probénécide PB ( agents masquant des agents de dopage). 
La technique SERS, est utilisée pour la
détection du probénécide, par adsorption
de cette molécule sur des nanoparticules
d'Ag dans une solution.

Question 23

qu’est ce que la résonance plasmonique de surface?

Answer 23

La SPR (Surface Plasmon Résonance) ou
Résonance Plasmonique de Surface est un
phénomène physique au cours duquel les
électrons d’une surface métallique (par
exemple à base d’argent, de cuivre ou
d’or) oscillent collectivement sous l’effet
d’une irradiation lumineuse dans des
conditions de réflexion totale.

Question 24

donnez la loi de snell-descartes ?

Answer 24

𝑠𝑖𝑛𝜃𝑖𝑛𝑐 ≥𝑛2/𝑛1= sin𝜃𝑙𝑖m

Question 25

donnez PRINCIPE DE LA SPR ?

Answer 25

Si l’interface entre les deux milieux est
recouverte d’une fine couche
métallique:
il existe un angle spécifique 𝜃𝑆𝑃𝑅, où
les électrons de surface de celle-ci
entrent en résonance avec le champ
électrique des photons issus du rayon
incident.
il s’agit de la résonance plasmonique
de surface. Ce phénomène a pour
conséquence une chute drastique de
l’intensité de la lumière réfléchie

Question 26

donnez les deux conditions de la SPR?

Answer 26

• la partie réelle de la permittivité du métal à
  la longueur d’onde d’excitation doit être
  négative. C’est le cas pour l’or, de l’argent ou
  du cuivre dans le visible et le proche
  infrarouge.
• il doit y avoir égalité du vecteur d’onde de la
  lumière incidente et celui du plasmon de
  surface

Question 27

donnez la loi de l’angle de résonance SPR?

Answer 27

𝜃𝑆𝑃𝑅 = arcsin ( 1/𝑛1 √(𝑛𝑑² 𝑛𝑚²)/(𝑛𝑑² + 𝑛𝑚²))

Question 28

utilisations de la SPR?

Answer 28

• théranostique
• sécurité alimentaire
• survaillance de l’nevironnement
• pharmacie

Question 29

pourquoi est ce qu’on a un décalage de l’angle téta spr lorsque on a des molécules fixées sur la surface ?

Answer 29

car l’indice de refraction change.
en effet n change donc téta SPR change, et donc on peut déterminer la concentration des molécles à partir de cette téta.
les molécules absorbent une partie de l’intergie ( c pour ça qu’on a un décalage vers les plus grandes longueurs d’ondes).
la bande de l’absorption sera décalé.

Question 30

qu’est ce qui permet de dire qu’on a un chnagement de l’indice de refraction n du milieu lors de la liaison de molécules dans la méthode SPR?

Answer 30

le décalage de l’angle de résonance 𝜽𝑺𝑷R

Question 31

décalage détectable de l’angle de résonance fournit diverses informations sur?

Answer 31

― le taux d’interaction,

― les constantes de vitesse cinétique

Question 32

Avantages et inconvénients de la technique résonance de plasmon de surface?

Answer 32

Avantages:
-Facile à utiliser
-Peut répondre simultanément à plusieurs réactants
-Très précis
-Possibilité d’utiliser des fibres optiques pour un transport efficace des photons
-Très grande sensibilité (bio-luminescence, SPR))
Inconvénients:
-Dépend de la possibilité des réactifs
-Domaine dynamique restreint (loi de Beer/Lambert)
-Difficile à miniaturiser
-Réponse peut être lente