COURS 2

Question 1

propriétés communément utilisé pour fractionner dans les différents types de chromato

Answer 1

chromato d’affinité : spécificité
chromato gel filtration: taille
chromato par echange d’ions: intéractions ioniques

Question 1

qu’est ce qui compose un échangeur d’anion et qu’est ce que ca fait

Answer 1

support insoluble R positif
Échangeur A négatif
l’échangeur d’anion est remplacé par un anion de la solution de manière réversible

Question 2

l’affinité avec laquelle une prot se lie à un échangeur d’ion dépend de…

Answer 2

ph de la solution puisque ca fait varier la charge nette des prot

nature et concentration des autres ions en solution qui vont aussi compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ion

Question 3

quelles caractéristiques font varier le choix d’échangeur

Answer 3

nature de la matrice (la phase stationnaire de notre chromato)

type de groupement fonctionnel pour favoriser l’attachement de la prot

Question 4

Quel genre de matrice on utilise en chromatographie

Answer 4

polymères insolubles (ex:cellulose, agarose, dérivé de cellulose ou autre polymère) préparés sous forme de billes appelés RÉSINE

Question 5

complete la phrase

le reseau des … génère une surface de contact beaucoup plus grande/petite que la surface extérieure de la bille

Answer 5

pores, grande

Question 6

Explique ce qui serait présent dans une résine échangeuse de cation (échangeur cationique)

Answer 6

groupement négatif lié par covalence au support qui est aussi lié à un contre ion échangeable positif

Question 7

Si on parle d’un echangeur d’anion, quel groupement porte la charge positive?

Answer 7

le groupement accroché par covanlence au support

Question 8

Donc un échangeur d’anion a une charge … qui lui permet d’changer des ions avec une charge…

Answer 8

positive

negative

Question 9

comment on qualifie les échangeurs faibles ou forts

Answer 9

faibles: chargé a une gamme de ph restreint
forts: chargé de ph 3 à 10

Question 10

nomme et caractérise les 4 échangeurs possibles

Answer 10

QAE: échangeur anionique fort
sulfonate: échangeur cationique fort
DEAE: échangeur anionique faible partiellement chargé a partir de ph 7-8
CM: échangeur cationique faible chargé complètement à partir de ph 4.5

Question 11

Afin de se lier à l’échangeur, la protéine doit…

Answer 11

déplacer les contre ions pour s’attacher

Question 12

La protéine doit avoir une plus forte affinité pour l’échangeur que pour le contre ions, pourquoi?

Answer 12

parce que les contre ions lient aussi la protéine et l’empêchent de s’attacher au contre ion si ils ont une meilleur affinité avec la prot

Question 13

QU’est ce qui retarde la migration dans la colonne après un lavage avec un tampon?

Answer 13

l’affinité avec l’échangeur. Plus la prot a une grande affinité avec l’échangeur plus elle migre lentement dans le tube

Question 14

Lors de l’élution dune colonne filtre, deux types d’élution existe, eexplique

Answer 14

élution fractionnée : on ajoute un tampon avec une concentration en sel vrm supérieur à celui du lavage mais toujours la même (seulement dux élutions une à low salt et l’autre à high salt )

Élution par gradient: on utilise plusieurs solutions avec des concentration de sel de plus en plus grande (plusieurs élutions)

Question 15

comment on qualifie la limite d’exclusion dans la chromato par gel filtration

Answer 15

les pores dans les billes du gel sont suffisamment grands afin de permettre
la pénétration complète des petites molécules, mais ils ne laissent pas pénétrer toutes les protéines à partir d’une certaine taille

Question 16

Dequoi est constitué la phase stationnaire dans la chromato par gel filtration

Answer 16

a phase stationnaire (résine) consiste en un réseau de polymères réticulé
possédant des pores, fabriqué sous forme de billes

Question 17

nomme trois type de phase stationnaire possible pour la chromato par gel filtration

Question 18

de quoi dépend la porosité du gel formant les billes ?

Answer 18

de la masse moléculaire du polymère
* du nombre de liaisons croisées qui se forment entre les molécules du
polymère (pontages)

Question 19

limites d’exclusion du sephadex et du sepharose

Answer 19

les limites d’exclusion varieront de 0.8 à 800 kDa pour le Sephadex, et jusqu’à 40 000 kDa pour le Sepharose

Question 20

C’est quoi le volume d’elution dune prot

Answer 20

c’est le volume de solvant nécessaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne

Question 21

comment on calcul le volume d’elution relatif

Answer 21

Vt = Vx + Vo
où Vx = le volume occupé par les billes
Vo = le volume mort (volume de solvant qui entoure les billes, ~35% de Vt) Vt = le volume total de la colonne

Question 22

pourquoi on dit que si on connait le volume d’elution relatif, on peut connaitre la masse d’une prot

Answer 22

il existe une relation linéaire entre le volume d’élution relatif d’une protéine et le logarithme de sa masse moléculaire

Question 23

une protéine ayant une petite masse a un volume relatif…

Question 24

explique le principe de dialyse

Answer 24

la dialyse permet de séparer les molécules selon leurs tailles grâce à l’utilisation de membranes semi-perméables qui présentent des pores de taille inférieure aux protéines

Question 25

2 moments ou on utilise la dialyse

Answer 25

Cette technique est fréquemment utilisée pour éliminer les sels présents dans un échantillon de protéine obtenu après précipitation (salting out) ou après élution avec un tampon riche en sels d’une colonne de chromatographie par échange d’ions

Question 26

Explique la chromato d’affinité

Answer 26

dans cette technique, un ligand, qui lie spécifiquement la protéine d’intérêt, est
fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte

Question 27

Donne deux caractéristiques spécifique de la chromato d’affinité

Answer 27

cette approche possède le grand avantage d’exploiter les propriétés biochimiques uniques de la protéine d’intérêt, au lieu d’utiliser des propriétés physico- chimiques qui sont aussi partagées par d’autres protéines
s

possède aussi l’avantage de pouvoir purifier la protéine d’intérêt à un très haut degré de pureté en une seule étape

Question 28

la quantité de protéine retenue sur la colonne en chromato d’affinité dépend de quoi?

Answer 28

la quantité de protéine retenue sur la colonne (P-L-M) dépendra:
- du Kd’ (l’interaction est trop faible si la valeur >10-4 M)
- de la concentration de protéine dans l’extrait
- du degré de liaison du ligand à la matrice (concentration de L-M)

Question 29

Propriétés d’une matrice de chromato d’affinité

Answer 29

a matrice utilisée pour la chromatographie d’affinité doit être: - chimiquement inerte
- avoir une grande porosité
- présenter de nombreux groupes fonctionnels capables de
former des liens covalents avec les ligands

Question 30

quelle matrice dans la chromato d’affinité est la plus frequemment utilisée

Answer 30

l’agarose

Question 31

Comment le ligand se lie a la matrice

Answer 31

a liaison par lien de covalence du ligand sur la matrice d’agarose se fait
en deux temps:
1) réaction de l’agarose avec du bromure de cyanogène, qui produit un intermédiaire “activé” et stable
2) le ligand réagit avec l’agarose activé pour donner un produit lié par covalence (Figure 10)

Question 32

pourquoi on ajoute un bras espaceur souple entre la matrice et le ligand dans la chromato d’affinité

Answer 32

lusieurs protéines sont incapables de se lier à leur ligand couplé
au bromure de cyanogène à cause d’interférence stérique avec la matrice d’agarose
- pour éviter ce problème, un bras “espaceur” souple est ajouté entre la matrice et le ligand (Figure 11)

Question 33

nomme les methodes non specifique de detection des protéines lors de l,élution d’une colonne filtre

Answer 33

les méthodes utilisées sont:
* absorption des protéines dans l’UV
* essai colorimétrique (essai de Bradford)
* essai enzymatique
* détection de la protéine sur gel SDS-PAGE (avec un colorant)
* détection de la protéine avec un anticorps (essai ELISA ou immunoblot)