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Diversité microbienne > Cours 1: Introduction et méthodes d'identification des microorganismes > Flashcards

Cours 1: Introduction et méthodes d'identification des microorganismes Flashcards

1
Q

Classification biologique hiérarchique

A
  1. Domaine
  2. Royaume
  3. Phylum
  4. Classe
  5. Ordre
  6. Famille
  7. Genre
    8 Espèce
  • Vers le bas : diminue nb mais ressemblance augmente
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2
Q

Nomme les méthodes classiques d’identification/quantification des microorganismes

A
  1. Isolement direct ou après enrichissement
  2. Examen au microscope
    - Champs clair
    - Champs noir
    - Contraste de phase
    - Hématimère
    - Fluorescence
  3. Dosage des substances spécifiques
    - ATP
    - Lipides
    - Pigments
  4. Analyse physiologiques
    - CLPP
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3
Q

Les étapes d’un isolement direct ou après enrichissement et la limite

A
  1. Terre dans un bouillon (enrichissement) ou directement dans première dilution en série
  2. Milieu de culture
  3. Tests biochimiques (microgaleries en tube ou macrogaleries) ET/OU coloration gram

Limite: Cultivabilité des microorganismes (0,01 à 70%)

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4
Q

Qu’est ce que permet la microscopie (exclue fluorescence) et quelle est la limite

A
  • Permet de déterminer famille si morphologie commune
  • Caractérisation de la taille
  • Quantification par l’hépatimère

Limite:

  • Types qui n’ont pas morphologie distincte
  • Seulement les organismes très abondant sont observables
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5
Q

Possibilité de coloration pour fluorescence

A
  1. Non-spécifique: colorant fluorescent agit sur une classe de biomolécules
  2. Spécifique: Ac contre molécule spécifique + molécule fluorescente

** Possibilité de cytométrie

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6
Q

Pour le dosage de l’ATP

  • Avantage
  • Utilisation luciférine et luciférase?
A
  • Demie vie courte quand mort mais reste stable (change pas en fx de l’age)
  • Permet dosage de l’ATP avec courbe étalon
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7
Q

Étapes de la quantification des lipides

A
  1. Sonification
  2. Chlorophorme pour séparer l’eau du chlorophorme contenant les lipides
  3. Phopholipides méthylés et purifiés –> Production méthyl esther d’a.gras
  4. Séparation et quantification par chromatographie gazeuse
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8
Q

Comment se fait la quantification des pigments

A
  • Mesure de la biomasse des algues par HPLC en fx du pigments
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9
Q

Quelle est la logique des analyses physiologiques

A
  • Détermination d’un pouvoir métabollique spécifique à une communauté (production O2,Co2)
  • CLPP (plaque 96 puits +colorant redox+ diff source E + organismes)
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10
Q

Avantages des méthodes classiques

A
  • Pas cher
  • Largement disponible
  • Permet quantifier organisme
  • Permet identification biodiversité et complexité d’une communaute
  • Études physiologique et phénotypiques disponibles
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11
Q

Désavantages des méthodes classiques

A
  • Bcp de temps et manip
  • Analayse adéquate et rapide des échantillons
  • Sélection du milieu de culture cruciale
  • Nécessite croissance de l’org
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12
Q

Nommes les méthode moléculaire d’identification et de quantification de organismes

A
  1. Mesure de la quantité d’a.nucléique
    a) Spectrométrie
    b) Fluorescence
  2. Techniques d’électrophorèse sur gel
    a) DGGE/TGGE
    b) RFLP
    c) AP-PCR
    d) Profil des plasmide
  3. Techniques de séquençage
    a) Séquençafe du gène ARNr 16s/18s
    b) Phylogénie basé sur gènes spécifiques
    c) Métagénomique
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13
Q

Explique le principe de la mesure d’ADN par spectrométrie

A
  • 1 cellule = 4 fragments ADn et 20 fragments ARN
  • ADN/ARN absorbe à 260 nm, prots à 260 nm et contaminant à 230 nm.
  • ADN pur si ratio 260/280 entre 1,8 et 2 ET si ratio 260/230 > 2
  • Permet quantification car on connait ratio et volume
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14
Q

Explique le principe de la mesure d’ADN par fluorescence

A
  • Utilisation agent intercalant d’a.n

- Dosage par rapport étalon

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15
Q

Explique le principe d’électrophorèse DGGE /TGGE et la limitation

A
  • Dénaturation de l’ADN en fx de la [agent dénaturant] ou de la tempéraute

Limitation: Pls copies des opérons ARNr 16s dans génomes pouvant avoir séquences différentes

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16
Q

Explique le principe d’électrophorèse RFLP et sa limitation

A
  • Digestion enzymatique de l’ADN à l’aide d’enzymes de restriction
    a) PCR avec sonde spécifique au gène d’intéret avant digestion
    b) Hybridation avec sonde spécifique au gène d’intéret après digestion

Limitation: Spécificité dépendante du choix des enzymes de restriction

17
Q

Explique le principe d’électrophorèse AP-PCR

A
  • Amplification non spécifiquye du génome non-spécifiques

- -> Empreinte spécifique à ch. échantillon

18
Q

Explique le principe d’électrophorèse des plasmides et la limitation

A
  • Nb et taille des plasmides peuvent être spécifique à un organisme

Limitation: Faux + (Transfert plasmide) Faux - (perte plasmide)

19
Q

Séquençage ARNr 16s 18s

  • Pour observer quelles relations
  • Méthodologie
A
  1. Observation des relation distantes via régions conservés
    Observation des relation proches par régions variables
  2. Méthodologie
    i. Extraction ADN de la biomasse
    ii. PCR avec gène cible ARNr 16 s OU clonage ADN + cribblage
    iii. Séquençage automatique
    iv. Comparaison avec séquence d’une base de données
20
Q

Qu’est-ce que le séquençage phylogénique basé sur les gènes spécifiques

A
  • Identification de microorg avec un pouvoir métabolique spécifique (PCR avec amorce spécifique)
21
Q

Qu’est-ce que la métagénomique et que permet telle

A
  • Séquençage complet des génomes
  • Permet de répondre aux 3 questions de l’écologie microbienne
    1. Qui: Par les séquences et leur distance relative
    2. Combien: Par le nb de séquences qui est trouve
    3. Qui fait quoi: Par l’identification de gènes avec des roles spécifiques
22
Q

Avantages des méthodes moléculaire d’identification

A
  • Analyse à haut débit et temps temps court
  • Aucune croissance et expertisse requise
  • Congélation pour analyse ultérieure
  • Transfert entre lab possible des échantillon et résultats
  • Seuil de détectiob faible
23
Q

Désanvantage des méthode moléculaire d’identification

A
  • Difficulté à standardisé l’extraction
  • Certaines méthode $$
  • Sélection des amorces et sondes cruciales

Diversité microbienne (6 decks)

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