Cours 1: Introduction et méthodes d'identification des microorganismes Flashcards
Classification biologique hiérarchique
- Domaine
- Royaume
- Phylum
- Classe
- Ordre
- Famille
- Genre
8 Espèce
- Vers le bas : diminue nb mais ressemblance augmente
Nomme les méthodes classiques d’identification/quantification des microorganismes
- Isolement direct ou après enrichissement
- Examen au microscope
- Champs clair
- Champs noir
- Contraste de phase
- Hématimère
- Fluorescence - Dosage des substances spécifiques
- ATP
- Lipides
- Pigments - Analyse physiologiques
- CLPP
Les étapes d’un isolement direct ou après enrichissement et la limite
- Terre dans un bouillon (enrichissement) ou directement dans première dilution en série
- Milieu de culture
- Tests biochimiques (microgaleries en tube ou macrogaleries) ET/OU coloration gram
Limite: Cultivabilité des microorganismes (0,01 à 70%)
Qu’est ce que permet la microscopie (exclue fluorescence) et quelle est la limite
- Permet de déterminer famille si morphologie commune
- Caractérisation de la taille
- Quantification par l’hépatimère
Limite:
- Types qui n’ont pas morphologie distincte
- Seulement les organismes très abondant sont observables
Possibilité de coloration pour fluorescence
- Non-spécifique: colorant fluorescent agit sur une classe de biomolécules
- Spécifique: Ac contre molécule spécifique + molécule fluorescente
** Possibilité de cytométrie
Pour le dosage de l’ATP
- Avantage
- Utilisation luciférine et luciférase?
- Demie vie courte quand mort mais reste stable (change pas en fx de l’age)
- Permet dosage de l’ATP avec courbe étalon
Étapes de la quantification des lipides
- Sonification
- Chlorophorme pour séparer l’eau du chlorophorme contenant les lipides
- Phopholipides méthylés et purifiés –> Production méthyl esther d’a.gras
- Séparation et quantification par chromatographie gazeuse
Comment se fait la quantification des pigments
- Mesure de la biomasse des algues par HPLC en fx du pigments
Quelle est la logique des analyses physiologiques
- Détermination d’un pouvoir métabollique spécifique à une communauté (production O2,Co2)
- CLPP (plaque 96 puits +colorant redox+ diff source E + organismes)
Avantages des méthodes classiques
- Pas cher
- Largement disponible
- Permet quantifier organisme
- Permet identification biodiversité et complexité d’une communaute
- Études physiologique et phénotypiques disponibles
Désavantages des méthodes classiques
- Bcp de temps et manip
- Analayse adéquate et rapide des échantillons
- Sélection du milieu de culture cruciale
- Nécessite croissance de l’org
Nommes les méthode moléculaire d’identification et de quantification de organismes
- Mesure de la quantité d’a.nucléique
a) Spectrométrie
b) Fluorescence - Techniques d’électrophorèse sur gel
a) DGGE/TGGE
b) RFLP
c) AP-PCR
d) Profil des plasmide - Techniques de séquençage
a) Séquençafe du gène ARNr 16s/18s
b) Phylogénie basé sur gènes spécifiques
c) Métagénomique
Explique le principe de la mesure d’ADN par spectrométrie
- 1 cellule = 4 fragments ADn et 20 fragments ARN
- ADN/ARN absorbe à 260 nm, prots à 260 nm et contaminant à 230 nm.
- ADN pur si ratio 260/280 entre 1,8 et 2 ET si ratio 260/230 > 2
- Permet quantification car on connait ratio et volume
Explique le principe de la mesure d’ADN par fluorescence
- Utilisation agent intercalant d’a.n
- Dosage par rapport étalon
Explique le principe d’électrophorèse DGGE /TGGE et la limitation
- Dénaturation de l’ADN en fx de la [agent dénaturant] ou de la tempéraute
Limitation: Pls copies des opérons ARNr 16s dans génomes pouvant avoir séquences différentes
Explique le principe d’électrophorèse RFLP et sa limitation
- Digestion enzymatique de l’ADN à l’aide d’enzymes de restriction
a) PCR avec sonde spécifique au gène d’intéret avant digestion
b) Hybridation avec sonde spécifique au gène d’intéret après digestion
Limitation: Spécificité dépendante du choix des enzymes de restriction
Explique le principe d’électrophorèse AP-PCR
- Amplification non spécifiquye du génome non-spécifiques
- -> Empreinte spécifique à ch. échantillon
Explique le principe d’électrophorèse des plasmides et la limitation
- Nb et taille des plasmides peuvent être spécifique à un organisme
Limitation: Faux + (Transfert plasmide) Faux - (perte plasmide)
Séquençage ARNr 16s 18s
- Pour observer quelles relations
- Méthodologie
- Observation des relation distantes via régions conservés
Observation des relation proches par régions variables - Méthodologie
i. Extraction ADN de la biomasse
ii. PCR avec gène cible ARNr 16 s OU clonage ADN + cribblage
iii. Séquençage automatique
iv. Comparaison avec séquence d’une base de données
Qu’est-ce que le séquençage phylogénique basé sur les gènes spécifiques
- Identification de microorg avec un pouvoir métabolique spécifique (PCR avec amorce spécifique)
Qu’est-ce que la métagénomique et que permet telle
- Séquençage complet des génomes
- Permet de répondre aux 3 questions de l’écologie microbienne
1. Qui: Par les séquences et leur distance relative
2. Combien: Par le nb de séquences qui est trouve
3. Qui fait quoi: Par l’identification de gènes avec des roles spécifiques
Avantages des méthodes moléculaire d’identification
- Analyse à haut débit et temps temps court
- Aucune croissance et expertisse requise
- Congélation pour analyse ultérieure
- Transfert entre lab possible des échantillon et résultats
- Seuil de détectiob faible
Désanvantage des méthode moléculaire d’identification
- Difficulté à standardisé l’extraction
- Certaines méthode $$
- Sélection des amorces et sondes cruciales
