COURS 1: DIVERSITÉ MICROBIENNE Flashcards
décrire le principe « une seule santé »
approche intégrée et unificatrice visant à équilibrer, et optimiser durablement la santé des pers. des animaux et écosystèmes
en gros reconnait que la santé des humains, animaux domestiques et sauvages, plantes et environnement en général est étroitement liée et interdépendante.
la diversité = les 3 domaines de la vie, soit
bacteria, archea et eukarya
définir la diversité microbienne
l’ensemble des espèces de MO existantes (à un moment)
souvent définie par un enviro, qui lui-même est défini par ses caractéristiques physico-chimiques
nommer un outil qui permet de visualiser la classification des organismes vivants et d’évaluer le lien évolutif entre eux
arbre phylogénétique
nommer des questions fondamentales de l’écologie microbienne et les concepts qui y sont associés
qui est là? (diversité)
combien sont là? (abondance)
qui fait quoi? (fonctionnalité)
MÉTHODES D’IDENTIFICATION ET DE QUANTIFICATION DES MO
méthodes classiques
nommer les 4 méthodes classiques d’identification/classification des MO vu en cours
-isolement direct
-examen au microscope
-dosage de substances spécifiques
-analyses physiologiques
décrire l’isolement direct (ou après enrichissement)
en gros choisir un milieu de culture et procéder
on peut faire des dilutions et mettre sur gélose
on peut faire des macro/micro galerie (ex: présence de catalase, ONPG, GLU etc)
permet de voir si gram+/-
quelle est la limitation de l’isolement direct?
cultivabilité des MO
nommer 4 méthodes d’examen au miscroscope
champ clair, champ noir, contraste de phase et fluorescence
laquelle des 4 méthodes classiques fait appel à l’hématimètre?
l’examen au microscope
nommer 2 limitations de l’examen au microscope
1) les divers types n’ont pas toujours une morphologie distincte
2)seulement les MO très abondants sont observables
décrire la microscopie à fluorescence non spécifique
les colorants fluorescents agissent sur une classe de biomolécules
coloration live dead: l’intercalant rouge entre dans les cellules perméabilisées, mortes (vert n’entre pas)
décrire la microscopies à fluorescence spécifique
les anticorps contre une molécule spécifique couplés à une molécule fluorescenete
décrire la microscopie à fluorescence spécifique directe vs indirecte
directe: un anticorps primaire à un fluorophore et il lie la cellule
indirecte: un anticorps secondaire à un fluorophore et cet anticorps secondaire lie un anticorps primaire qui lui lie la cellule
quel méthode permet de compter les cellules dans la microscopie à fluorescence?
cytométrie en flux
nommer 3 méthodes de dosage de substances spécifiques et décrire brièvement
-ATP: indique les cell vivantes;
-quantification des lipides: qt de phosopholipides des cellules procaryotes est stable en culture, leur compo change par contre (prob: bactéries mortes ont des phospholipides aussi)
-quantification des pigments: chlorophylle A
décrire comment quantifier via l’ATP?
bioessai luciférine-luciférase
sous l’action de la luciférase, la luciférine prod lumière quand y’a de l’ATP
limite de détection adéquate + bonne réplication
décrire comment quantifier les lipides?
1) extraire les lipides
2) phospholipides sont méthylés et purifiées pour produire des méthyle esters d’acides gras
3) séparation et quantification par chromatographie GAZEUSE
décrire comment quantifier les pigments
en quantifiant la chlorophylle A qui est une mesure pratique de la biomasse d’algues
analyse par HPCL: quantification relative de biomasse des différents groupes de MO producteurs de pigments
décrire la méthode d’analyse physiologique, ce qu’elle permet de déterminer
détermination d’un pouvoir métabolique spécifique à une communauté ou à un isolat
détermination du profil métabolique d’une communauté
nommer des exemples de ce qu’on peut observer par analyses physiologiques
-consommation de O2
-production de CO2
-fixation de CO2
-dégradation des xénobiotiques
nommer une méthode quantitative qui permet de faire des analyses physiologique
CLPP (community level physiological profile)
plaque 96 puits contenant différents substrats et sources d’énergie + un colorant redox + MO
que permet la méthode CLPP
caractériser le pouvoir métabolique et de le comparer avec celui d’un autre endroit, permet de relier un phénotype à un pouvoir métabolique
nommer des avantages des méthodes classiques
avantages: peu couteuses, vrm dispo, permet de quantifier les MO, bonne indication de la diversité/complexité d’une communauté, études physiologiques/phénotypiques possibles
nommer des inconvénients des méthodes classiques
bcp de temps et de manip, échantillons doivent être analysés immédiat, sélection des milieux de cultures est cruciale, nécessite croissance MO
CULTUROMIQUE
qu’est-ce que la culturomique?
science qui a pour but de rendre possible la croissance du plus grand nombre de MO possible dans une communauté microbienne
nommer un exemple de MO découvert par culturomique et son importance
thermus aquaticus, pour faire la Taq Pol en PCR :))
note: on ne peut jamais savoir à l’avance quelles recherches seront importantes
MÉTHODES D’IDENTIFICATION ET DE QUANTIFICATION DES MO
méthodes moléculaires
comment étudier l’ADN?
mesure de la quantité d’acide nucléiques
techniques d’électrophorèse sur gel d’agarose
technique de séquençage
nommer des techniques d’électrophorèse sur gel d’agarose
-hybridation ADN/ADN
-DGGE et TGGE (denaturating/temperature gradient gel electrophoresis)
-RFLP (restriction fragment length polymorphism)
-AP-PCR (arbritrary primers-polymerase chain reaction)
-profil des plasmides
nommer des techniques de séquençage
-séquençage de l’arn 16s ou 18s
-phylogénie basée sur les gènes spécifiques
-métagénomique
afin d’étudier l’ADN il est important de…?
l’isoler
nommer 2 façon d’isoler l’ADN
extraction d’une cellule bactérienne
extraction in situ (direct lysis)
et dans les 2 cas faut purifier avec colonne, extraction phénol/chloroforme et précipitation avec l’éthanol pour produire de l’ADN pure
MESURE DE LA QUANTITÉ D’ACIDES NUCLÉIQUES
nommer 2 méthode de quantification d’acides nucléiques
1) dosage de l’ADN par spectrophotométrie
(courbe; ratio 260/280 = 1,8-2 et ratio 260/230 inf à 2 both = ADN pur)
note 260= pic a. nuc
2) dosage de l’ADN par fluorescence: intercalants acides nucléiques, courbe standard, dosage
fluviomètre au lieu de spectrophotomètre (ligne droite; fluorescence selon concentration ADN)
TECHNIQUES D’ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL D’AGAROSE
décrire la méthode DGGE/TGGE
évaluer la dénaturation de l’ADN en fonction de concentrations variables en agents dénaturants
les différences dans la séquence (mutations ou changements) causent des différences dans la migration
possibilité d’exciser les bandes pour séquencer et identification
VRAI OU FAUX:
dans le cas de DGGE/TGGE, il est possible d’exciser les bandes pour séquencer et identifier?
VRAI
donner une limitation de DGGE/TGGE
plusieurs copies des opérons 16S-rRNA dans le génome peuvent avoir des séquences différentes
décrire la méthode RFLP (restriction fragment length polymorphism)
permet d’établir un profil de digestion de l’ADN à l’aide d’enzymes de restriction
basée sur les différence en motifs de restriction
sonde qui s’hybride pour cibler ADN intérêt
donner une limitation de la méthode RFLP
spécificité dépendante du choix des enzymes de restriction
décrire l’AP-PCR (arbitrary primes-PCR)
amplification non spécifique du génome
MAIS empreinte spécifique à chaque échantillon
basée sur la longueur des amplicons
décrire la méthode profils des plasmides
certains isolats bactériens contiennent 1 ou plusieurs plasmides
le nombre et la taille des plasmides peuvent être uniques à une bactérie donnée
donner 2 limitations de la méthode profils des plasmides
faux négatifs: perte de plasmides par la bactérie
faux positifs: transfert de plasmides entre les bactéries
PCR QUANTITATIVE
décrire
amorces spécifiques
dénaturation, appariement, extension
CT; nombre de cycles qui permet la détection (+ t’as d’ADN au début, + CT est petit)
SPECTROMÉTRIE DE MASSE
que permet la spectrométrie de masse?
permet la séparation et l’identification d’ions moléculaires de poids moléculaires élevés (protéines, peptides, ADN, polymères synthétiques)
quel type de plaque est utilisée par la spectrométrie de masse?
plaque MALDI (les molécules à séparer s’y collent et migrent après afin d’atteindre le détecteur)
comment on « défini » les spectres obtenus?
analyse avec base de données
nommer des avantages de la spectrométrie de masse
rapide, peu couteuse, peu de gestes techniques, facilite l’échange des résultats et des expertises entre labo
nommer des inconvénients de la spectrométrie de masse
nécessité de culture bactérienne (pas vrm un inconv, imp pour diagnostic)
difficulté d’identification en cas de contamination ou de cultures mixtes
identification limitée aux MO présents dans les bases de données
TECHNIQUES DE SÉQUENÇAGE
quel gène est souvent séquencé et pourquoi?
le gène de l’rARN 16S/18S (18S= euca)
trouvé dans tous les organismes (bactérie, archée, eucaryote 18s)
régions hautement conservées pour observer des relations distantes
régions variables pour observer les relations proches (dernier événement de l’évolution)
décrire la méthodologie du séquençage via ARNr 16S
biomasse ➡️ ADN ➡️ PCR qui donne gènes ARNr 16S OU clonage qui donne banque génomique qui donne ARNr 16S ➡️ séquençage automatique qui permet caractérisation phylogénétique de chaque membre de la population
séquençage automatisé = rapide, efficace, fiable
comparer avec banque de données
décrire la méthode de séquençage basée sur la phylogénie en lien avec les gènes spécifiques
identifier les MO avec un pouvoir métabolique spécifique
exemple fixation de l’azote, opérons nif
décrire la méthode de séquençage basée sur la métagénomique
séquençage complet des génomes
pas besoin d’isoler la bactérie!!!
selon le nombre de morceau de chaque bactérie on peut dire celle-là était plus abondante
comment le séquençage permet de répondre à ces questions:
qui est là?
combien sont là?
qui fait quoi?
qui est là?: nombre de séquences différentes et leur distance relative pour un même gène
combien sont là? nombre de fois où une séquence d’un gène est retrouvée
qui fait quoi?: identification de gènes spécifiques ayant un rôle défini
le séquençage permet de voir les fonction des gènes récupéré par extraction d’ADN et séquencés?
OUI
on peut faire un regroupement bidirectionnel d’échantillons et de fonctions codées basé sur un enrichissement relatif des processus fonctionnels KEGG?
OUI
nommer des avantages des techniques de séquençage
analyses haut-débit avec des temps courts, aucune croissance bactérienne et aucune expertise est requise, congélation pour analyse tardives: facilite donc transfert, facilite échanges de résultats, seuils de détection faibles :)
nommer des inconvénients des techniques de séquençage
difficulté de standardisation des méthodes d’extraction, méthodes dispendieuses (certaines), sélection des amorces et sondes est cruciale (biais de détection)
