CM5 Bis Southern Blot

Question 1

En quoi consiste le Southern Blot ?

Answer 1

Après une électrophorèse le Southern Blot consiste en un transfert sur membrane du produit de la migration et à l’hybridation avec une sonde marqué spécifique du/des fragments d’ADN d’intérêt

Question 2

Dis moi les 8 ou 9 étapes du Southern Blot ?

Answer 2

1. Extraction de l’ADN
2. ADN digéré par les enzymes de restriction (ou produit de PCR )
3. Les fragments d’ADN sont soumis à une électrophorèse (gel d’Agarose )

Visualisation de tous les fragments d’ADN en trempant le gel dans une solution de bromure d’éthidium (BET) + exposition à l’UV

4. Dénaturation de l’ADN double brin en trampant le gel d’électrophorèse dans une solution alcaline ( NaOH )
5. Transfert une feuille de membrane en nitrocellulose (ou en nylon) est placé sur le gel.

Pression appliqué sur le gel avec une pile de papier + un poids sur la membrane et le gel

Permettant le déplacement de l’ADN contenu dans le gel sur la membrane par capillarité grâce à une solution saline.

L’ADN va se fixer sur la membrane

6 . Chauffage de la membrane

( exposé au rayonnement si nitrocellulose

ou exposé au rayonnement UV si nylon )

Pour fixer l’ADN sur la membrane de manière permanente ( formation de liaisons covalente entre ADN-membrane )

7. Hybridation
   La membrane est ensuite mise en contact avec une sonde marqué ( avec un radio-isotope, un fluorochrome ou la digoxygénine ) spécifique de la séquence d’ADN recherchée

8 . Révélation
Visualisation de l’hybridation selon le type de sonde par autoradiographie , imagerie en excitant le fluorochrome ou avec un anticorps antidigoxygénine détecté par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome ou à une enzyme

Question 3

Lors de quels applications est réalisé le Southern Blot ?

Answer 3

-Identification d’organisme transgéniques

-Diagnostique ( mutation , infection virale )

-Test de paternité

• Médecine légale

Question 4

Dans le cas d’une recherche de mutation , application du Southern Blot , que provoque une mutation ?

Answer 4

Une mutation provoque l’addition d’un site de restriction HindIII

Technique “Restriction Fragment Lenght Polymorphism” (RFLP)

Question 5

Qu’est ce que les microsatellites et dans quel application est elle utilisée?

Answer 5

Microsatellites : séquençe répétés qui peuvent avoir des tailles variables et qui sont spécifiques à chaque individu

Question 6

Qu’est que la sonde R ?

Answer 6

La sonde R est spécifique d’une de ces séquences sur le chromosome 11