Chimica combinatoriale Flashcards
Come può avvenire la sintesi mediante chimica combinatoriale?
- In parallelo: uso tanti pozzetti con una serie precisa composti, so esattamente cosa c’è in ogni pozzetto ma ne testo molti in contemporanea
- In miscela: in ogni pozzetto faccio reazioni diverse e ottengo quindi miscele diverse che devo poi testare. Ottengo milioni di composti in poco tempo ma se una miscela funziona devo capire quale dei prodotti della miscela è realmente attivo (deconvoluzione)
quali sono i metodi di deconvoluzione per la sintesi in fase liquida?
Metodo delle librerie ortogonali
Si preparano varie soluzioni dove una componente è fissa e le altre variano, ogni composto apparirà in 2 librerie.
Quando faccio l’analisi farmacologica, se mi identifica 2 composti che funzionano, posso identificare quale componente è responsabile per il funzionamento (quella in comune).
Metodo delle sottolibrerie
Si preparano tanti contenitori con tante librerie diverse, testo i composti e se funzionano uso le sottolibrerie.
quali sono i metodi usati per la sintesi parallela in fase liquida?
Tea bag method
Si usano bustine di polipropilene poroso (permette lo scambio di fluoidi) con all’interno la resina su cui verrà costruito il polipeptide.
1- Ogni bustina viene numerata e viene aggiunto un tipo di amminoacido protetto (diverso per ogni busta)
2- Si mettono tutte le bustine in un’unica soluzione di deprotezione e lavaggio
3- Si possono anche staccare dalla resina in contemporanea se sono stati utilizzati gli stessi linker
Metodo degli spilli
Si usano spilli ricoperti da resina con il linker e si immergono in una serie di pozzetti, ognuno con uno specifico amminoacido.
Viene poi fatta avvenire la reazione, estratti gli spilli e inseriti in altri pozzetti con soluzione per deproteggere (es TFA). Si fa un lavaggio e poi si immergono gli spilli in nuovi pozzetti contenenti altri amminoacidi.
In questo modo si sa la sequenza aminoacidica di ogni peptide ma con un risparmio di tempo significativo perché le reazioni sono avvenute simultaneamente.
Come funziona il metodo mix and split?
Se voglio creare un tripeptide con Gly, Ala e Val, ho 27 combinazioni possibili:
1- Prendo 3 resine: ad una lego Gly, all’altra Ala e all’ultima Val
2- Miscelo le resine insieme e le divido in 3 contenitori che conterranno quindi miscele equimolari di Gly, Ala e Val (B)
3- Aggiungo in uno Gly, nell’altro Ala e nell’ultimo Val
4- Nel frattempo, metto da parte un po’ di resina di ogni campione
5- Mescolo tutto insieme e divido in 3 contenitori (C)
6- Aggiungo in uno Gly, nell’altro Ala e nell’ultimo Val
7- Ottengo 3 esperimenti e 27 tripeptidi, su ogni beads c’è un singolo tipo di tripeptide
8- Testo i campioni
Come posso controllare se il metodo mix and split ha funzionato correttamente?
Per controllare l’attività del campione non è necessario staccarlo dalla resina, posso testarlo direttamente e poi sequenziarlo se vedo affinità.
Posso individuare il tripeptide attivo posso anche fare fluorimetria: sfrutto l’interazione tra il recettore specifico legato ad una molecola fluorescente e il mio tripeptide. Se c’è interazione allora si ha un segnale luminoso. È una tecnica complessa.
La tecnica d’elezione per individuare il tripeptide corretto in miscela è la recursive deconvolution.
Esempio:
1- Genero la libreria di tripeptidi e riconosco che quelli attivi (+) hanno il l’amminoacido rosso nell’ultima posizione di legame (CP).
2- Posso quindi accoppiare l’amminoacido rosso ai 3 campioni messi da parte solo il secondo ciclo (B) per ottenere i campioni D
3- Dopo la scissione del polimero si formano 3 campioni (E) e quelli con l’amminoacido blu in seconda posizione risultano attivi
4- Accoppio l’amminoacido e poi il rosso ai 3 campioni A (ottengo F)
5- Dopo la scissione del polimero, testo i composti (G) e osservo qual è attivo (tripeptide finale)
Quali sono i metodi di purificazione dei peptidi??
reversed-phase HPLC
cromatografia di filtrazione su gel
cromatografia a scambio ionico
