chapitre 4 méthodes Flashcards
Virus
vecteurs viraux, enzymes virales …
reverse transcriptase, ANR polymérases…
Procaryotes
Escherichia coli
Clonages d’ADN, amplification de plasmides
Production de protéines recombinantes
Eucaryotes unicellulaires
Saccharomyces cerevisiae (levure) Production de protéines recombinantes Approches génétiques
Transgénèse
le fait d’introduire un ou plusieurs gènes dans un organisme afin que ce ou ces derniers y soient exprimés
Transgénèse classique
La transgénèse classique se réalise en injectant de l’ADN linéaire dans un ovocyte fécondé afin qu’il soit incorporé aléatoirement dans le génome murin.
Transgénèse par recombinaison homologue
La recombinaison homologue est à l’origine un mécanisme mis en place par la cellule lors ou de la méiose ou en cas d’erreur dans la réplication de l’ADN. La cellule reconnaît des portions de son ADN identiques à celui du transgène et échange ce dernier avec son gène. Cela conduit à l’insertion du transgène à l’endroit même où les portions identiques étaient présentes. Ainsi, les biologistes peuvent introduire leur transgène où ils le souhaitent dans le génome en choisissant quelle portion identique à celui-ci ils insèrent à leur transgène.
KO (Knock Out)
Il s’agit de l’inactivation d’un gène en générant des codons STOP précoces qui inactivent la protéine et conduisent à sa dégradation par la cellule en effet, si l’on ne propose pas à la cellule d’ADN de remplacement après avoir sectionné une séquence, cette dernière tentera de réparer l’ADN sans recombinaison homologue, ce qui crée un décalage du cadre de lecture et donc des codons stop prématurés (cf. cours d’UE2 sur la traduction). La meilleure façon d’identifier le rôle d’un gène cible est de l’inactiver.
KI (Knock In)
Il s’agit du remplacement d’un gène par le transgène (qui peut être un gène rapporteur, une modification du gène initial ou autre).
CRISPR
signifie “Clustured Regularly Interspaced“ Short Palindromic Repeats’. Il s’agit de répétitions palindromiques situées dans le génome des bactéries. Elles sont identiques à des séquences d’ADN viral et ont été introduites pour servir de défense contre ces dernières.
Palindrome
du grec pálin « en arrière » et drómos « course ». Désigne un texte ou un mot dont l’ordre des lettres reste le même qu’on le lise de gauche à droite ou de droite à gauche, comme dans la phrase « Ésope reste ici et se repose » ou encore « Elu par cette crapule ».
vecteur d’expression
portion nucléotidique exogène qui permet d’exprimer un gène
dans une cellule hôte. Il peut s’agir de plasmides, mais aussi d’autres choses comme des virus.
4 manières de faire entrer de l’ADN dans les cellules
Lipofection
Micro-injection
Electroporation
Bombardement avec des particules (or ou tungstène)
Protéine est plus stable que l’ADN?
Faux, l’ADN est plus stable et permet de
synthétiser plus de protéines
La centrifugation
une méthode qui permet de séparer tous les constituants cellulaires selon leur taille et leur forme en réalisant plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante.
Le Western Blot
une technique très utilisée par les chercheurs en biologie cellulaire lorsqu’ils travaillent sur des protéines (on en trouve beaucoup dans l’épreuve du concours aussi). Il s’agit d’un SDS-PAGE électrotransféré sur une membrane où seules les protéines souhaitées sont révélées de manière spécifique grâce aux anticorps (sa méthode de détection par les anticorps est décrite dans la partie Amplification d’un signal de révélation par anticorps). Néanmoins, les autres protéines sont toujours présentes mais ne sont pas révélées. Il permet donc d’apprécier la présence ou non d’une protéine dans un extrait cellulaire et de comparer sa quantité relative avec d’autres situations.
