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Microbiologie > Chapitre 4 Colorations en Microbiologie > Flashcards

Chapitre 4 Colorations en Microbiologie Flashcards

1
Q

COLORATIONS EN MICROBIOLOGIE

HISTORIQUE

A

Mises au point au 19e siècle. Durant le dernier siècle, l’utilisation des colorations a vraiment aidé au développement technologique tant et si bien que maintenant, la coloration bactérienne est une technique de base dans l’identification bactérienne.

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2
Q

COLORATIONS EN MICROBIOLOGIE

Les colorants existent sous forme de?

A

préparation aqueuse ou organique

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3
Q

COLORATIONS EN MICROBIOLOGIE

Ils peuvent être utilisés pour :

A

Colorer du matériel biologique
Comme indicateur de pH dans les milieux de culture
Comme inhibiteur dans les milieux de culture(gram-/+Crystal violet)
Comme indicateur d’oxydoréduction

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4
Q

PRINCIPES DE LA COLORATION

Tous les colorants ont au moins deux propriétés en commun?

A

Présence de groupes chromophores.

Posséder un groupe auxochrome

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5
Q

PRINCIPES DE LA COLORATION

Ils sont colorés grâce à la présence de groupes chromophores

A

Qui ont pour origine la molécule de benzène ou une quinone. Ils peuvent se lier aux cellules par interaction ionique, covalente ou hydrophobe.

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6
Q

PRINCIPES DE LA COLORATION

Les groupes de colorants qui nous intéressent sont ionisables et ils sont divisés en deux groupes :

A

Les colorants basiques ou cationiques et les colorants acides ou anioniques.

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7
Q

PRINCIPES DE LA COLORATION

un groupe auxochrome

A

Qui est un radical ionisant attaché à la partie du colorant possédant le chromophore. Ces radicaux possèdent des charges. Ils sont soit cationiques (NH2) ou anioniques(COOH-, OH- , SO3 H- ). Il permettra au colorant de s’attacher au tissu ou à la cellule.

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8
Q

PRINCIPES DE LA COLORATION

Le tissu ou le micro-organisme basophile (charge négative, anionique, acide) se colore par

A

Des colorants possédant une charge positive donc : basiques, cationiques.
ex: La surface des cellules bactériennes, l’ADN, l’ARN, le mucus, le cartilage, les acides nucléiques, les protéines et la chromatine sont: basophile anionique, de charge négative, acide

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9
Q

PRINCIPES DE LA COLORATION

Le tissu ou la cellule acidophile (charge positive, cationique, basique) se colore par

A

Des colorants possédant une charge négative donc : acide, anionique.
ex: Le collagène, les érythrocytes, les éosinophiles, les mucosubstances carboxylés et sulfatés sont : acidophiles, cationiques, de charge positive, basique.

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10
Q

Les colorants basiques utilisés en microbiologie, ils sont généralement vendus sous forme de chlorures :

A 
bleu de méthylène
fuchsine basique
cristal violet
safranine
vert de malachite 
carbolfuschine
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11
Q

Les colorants acides:

A

fuchsine acide
éosine
rose Bengale

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12
Q

ÉTAPES D’UNE COLORATION

On reconnaît deux types de fixation :

A

la fixation par la chaleur

la fixation chimique

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13
Q

LA FIXATION PAR LA CHALEUR

A

Il s’agit de chauffer doucement un film bactérien séché à l’air. Ce procédé permet de conserver correctement la morphologie générale, mais pas les structures intracellulaires.

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14
Q

LA FIXATION CHIMIQUE

A

On utilise ce procédé pour protéger les structures cellulaires fines et la morphologie de microorganismes plus grands et plus délicats.

Ces fixateurs pénètrent dans les cellules et réagissent avec les composantes cellulaires, le plus souvent des protéines et des lipides afin de les rendre inactifs, insolubles et immobiles.

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15
Q

Les mélanges de fixateurs utilisés le plus souvent sont?

Fixateurs chimiques?

A 
le méthanol
l’éthanol
l’acide acétique
le chlorure mercurique
le formaldéhyde
le glutaraldéhyde.
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16
Q

Ne sont pas des colorations différentielles.

A

Les colorations de spores, de flagelles, la coloration pour la mise en évidence des capsules.

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17
Q

La coloration à l’encre de Chine est?

A

Une coloration négative des bactéries puisque ce n’est pas la bactérie qui est colorée, mais les éléments qui l’entourent.

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18
Q

LA COLORATION DE GRAM

A

Les techniques de coloration différentielle divisent les bactéries en groupes distincts basés sur les propriétés de coloration. La coloration de Gram a été mise au point par Hans Christian Gram, il y a un peu plus de 100 ans.

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19
Q

UTILITÉ DE LA COLORATION DE GRAM

A

Permet aussi de sélectionner les milieux de culture appropriés pour la croissance et l’identification de la bactérie soupçonnée. Elle est donc une coloration de routine. Fournir une identification provisoire des micro-organismes contenus dans un échantillon en déterminant:

la taille des bactéries
la forme des bactéries
l’arrangement bactérien

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20
Q

PRINCIPE DE LA COLORATION DE GRAM

A

Coloration différentielle basée sur les propriétés de la paroi cellulaire des bactéries.

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21
Q

PRINCIPE DE LA COLORATION DE GRAM

Pour les Gram positifs:

A

Le peptidoglycane agit avec les acides téichoïques comme barrière de perméabilité en empêchant la perte de violet de cristal chez les bactéries. L’alcool réduit la dimension des pores du peptidoglycane. Le complexe colorant-iode est maintenu pendant la décoloration. Ce même complexe masque l’action de la safranine et les bactéries demeurent bleu violet.

22
Q

PRINCIPE DE LA COLORATION DE GRAM

Pour les Gram négatifs:

A

La paroi cellulaire des Gram négatifs est très poreuse puisqu’elle contient de nombreux lipides. Durant la coloration, le traitement à l’alcool acide extrait assez de lipides de la paroi cellulaire pour en augmenter la porosité et en éliminer plus facilement le violet de cristal combiné à l’iode. Le complexe violet de cristal-lugol est remplacé par la safranine. Les bactéries seront colorées en rose ou rouge.

23
Q

Gram positif

A

Couche épaisse de peptidoglycane (90% de tous les constituants de la paroi Gram+)

lipides (inférieur à 4%)

acides teichoïques
polyosides
protéine M
acide polyglutamique

24
Q

Gram négatif

A

Portion élevée de lipides (11 à 22%)
Trois couches de composition chimique différente:

couche mince de peptidoglycane
lipopolysaccharides
lipoprotéines

25
Q

Principe de la coloration de Gram (paroi d’une bactérie Gram positif)

A

Peptidoglycane agit avec les acides téichoïque comme barrière de perméabilité en empêchant la perte de violet de cristal
l’éthanol réduit la dimension des pores du peptidoglycane. Le complexe colorant-iode est maintenu pendant la décoloration
Le complexe violet de cristal-lugol masque l’action de la safranine
Les bactéries demeurent bleu-violet

26
Q

Les types de colorations:

A 
LA COLORATION DE GRAM 
COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN 
AURAMINE-RHODAMINE 
KINYOUN MODIFIÉ 
COLORATION DE SPORES 
COLORATION DE WIRTZ-CONKLIN 
COLORATION DE FLAGELLES 
COLORATION À L’ENCRE DE CHINE 
COLORATION MAY-GRÜNWALD-GIEMSA 
COLORATION D’ERNST-NEISSER 
COLORATION D’ALBERT 
COLORATION DE LOEFFLER 
ORANGE D’ACRIDINE 
CALCOFLUOR
FUNGI-FLUOR 
COLORATION DE GRAM À ÊTRE RECOLORÉE PAR CALCOFLUOR OU PAR FUNGI-FLUOR
27
Q

ÉTAPES DE LA COLORATION DE GRAM
Eau Courant
Contrôle positif: Staphylococcus aureus ATCC 25923
Contrôle négatif : Escherichia coli ATCC 25922

A
  1. Cristal violet (1min)
  2. L’iode ou Lugol (1min)
  3. Alcool acide, l’éthanol, de l’acétone ou l’alcool éthylique 95% (5 à 10 sec)
  4. Safranine ou fuschine basique (1min)
28
Q

Cause d’une mauvaise coloration de Gram?

A

pH du colorant
utilisation de colorants périmés
dépôt de colorant dû à une mauvaise filtration
temps de contact inadéquat des colorants
temps de décoloration inadéquat
Les antibiotiques peuvent affecter la coloration de Gram.
Il est très important de toujours fixer le matériel sur la lame avant de débuter toute coloration.
Cette étape prévient que le spécimen ne décolle de la lame lors du processus de la coloration.

29
Q

COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN
Principe
(MISE EN ÉVIDENCE DES MYCOBACTÉRIES)
Bacille de Koch TB

A

Les mycobactéries sont recouvertes d’une couche épaisse de cire qui résiste aux colorants. Une fois colorée, la cellule de la mycobactérie résiste à la décoloration par des solvants organiques forts comme l’alcool acide. Les bactéries démontrant de telles propriétés sont connues sous le nom de bacilles alcoolo acido-résistants (« acid fast bacilli » en anglais). Ce phénomène a été découvert en 1881 par Ziehl et Neelsen, d’où le nom de la coloration.

30
Q

ÉTAPE DE COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN
Eau distillée
(MISE EN ÉVIDENCE DES MYCOBACTÉRIES)
Bacille de Koch TB

A
  1. Carbol fuschine chauffée à émission de vapeur (3min)
  2. Alcool-acide 3% (2-3min)
  3. Bleu méthylène ou au vert de malachite (2-3min)
31
Q

AURAMINE-RHODAMINE
Principe
Utilisé avec le bon filtre
Coloration fluorescente pour TB

A

L’auramine O et le rhodamine B sont liés à l’acide mucolique retrouvée dans la paroi cellulaire des mycobactéries.

Le colorant non lié est enlevé par la solution de décoloration.

Le permanganate de potassium agit comme contre-colorant supprimant la fluorescence non spécifique.

32
Q

ÉTAPE AURAMINE-RHODAMINE
Eau distillée 40X
Contrôle négatif: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Contrôle positif: Mycobactérium tuberculosis H3+Ra

A
  1. Auramine-Rhodamine ne pas chauffer (15min)
  2. Différencier (2min)
  3. Contre colorer au permanganate de potassium (2min)
    Sécher lame a noirceur/perte de fluorescence à la clarté

N.B.: Essuyer l’huile sur l’objectif entre chaque lame afin d’éviter le transfert de bactérie alcoolo acido-résistante d’une lame à l’autre.

33
Q

KINYOUN MODIFIÉ

Principe

A

Les Nocardia, Rhodococcus et certains Actinomyces possèdent de l’acide mucolique intermédiaire dans leur paroi cellulaire.
La coloration de Kinyoun modifiée met en évidence une acido-résistance plus ou moins complète de ces germes. Cette acido-résistance s’accroît en cultivant ces germes dans des milieux riches en lipides (ex.: Lowenstein, lait).

34
Q

ÉTAPE KINYOUN MODIFIÉ
Eau courante 1000X
Fixer la lame à la chaleur

A
  1. Kinyoun carbolfuschine ne pas chauffer (5min)
  2. Éthanol 50%
  3. Acide sulfurique 1% (1-2min)
  4. Contre color bleu méthylène (1min)
35
Q

COLORATION DE SPORES

3 méthodes pour la coloration des spores?

A

Méthode de Schaeffer-Fulton (vert de malachite et fuchsine)
Méthode de Dorner (fuchsine et nigrosine)
Méthode de Wirtz-Conklin

36
Q

COLORATION DE WIRTZ-CONKLIN

Principe

A

L’enveloppe des endospores des bactéries est imperméable à la plupart des colorants usuels. Ce phénomène est dû à leur composition chimique. Les bactéries sporulantes colorées au Gram, montreront un espace clair non coloré à la place de l’endospore. Les techniques de coloration des spores ont toutes le même principe qui est de favoriser par chauffage, l’entrée des colorants à travers l’enveloppe de la spore. Le refroidissement de la membrane empêche le colorant de s’échapper de la spore. Le reste de la bactérie est ensuite contre colorée.

37
Q

ÉTAPE COLORATION DE WIRTZ-CONKLIN
Eau courante
Résultats : Bacilles : rouges
Spores : vertes

A
  1. Vert de malachite à 5% (3-6min ou 30min sans chauffage)

2. 0.5% safranine (30sec)

38
Q 
COLORATION DE FLAGELLES
Principe
Méthode de Leifson
Méthode de Rhode
Attention préparation du solution de colorant, ne pas prendre solution réfrigérer avec précipité. Ne pas re-mélanger
A

Les flagelles ne peuvent être mis en évidence de façon précise à l’état frais ou par toute autre technique de coloration habituelle. La coloration de flagelle permet une imprégnation par l’acide tannique laissant voir les flagelles après être colorées à l’acide tannique. C’est une coloration qui demande beaucoup de minutie.

Ne pas shaker, mais tourner pour sécher
On laisse la goutte du spécimen tomber lentement par gravité avec une petite angle. Assurer le trajet droit

39
Q

COLORATION À L’ENCRE DE CHINE

A

Il s’agit donc d’une coloration négative puisque l’encre de Chine ne colore pas la bactérie, mais les éléments qu’il y a autour. La coloration à l’encre de Chine permet d’observer au microscope la présence de capsule chez la bactérie.

40
Q

COLORATION À L’ENCRE DE CHINE
Les bactéries qu’elles entour sont dites encapsulées et considérées comme virulentes. On observe une capsule chez certaines bactéries provenant de spécimens cliniques. Parmi ces bactéries on compte?

A

le Streptococcus pneumoniae
le Klebsiella pneumoniae
le Cryptococcus neoformans

Pour le Cryptococcus neoformans, il s’agit d’un critère d’identification important. La coloration à l’encre
de Chine d’un spécimen de liquide céphalo-rachidien permet d’identifier avec confiance le Cryptococcus neoformans chez un patient immunodéprimé.

41
Q

COLORATION MAY-GRÜNWALD-GIEMSA
(FROTTIS SANGUINS, PARASITES)
PRINCIPE

Triton X-100

A

En hématologie pour l’identification des cellules sanguines. C’est aussi la coloration la plus sûre pour identifier les parasites sanguins, en particulier pour les frottis minces. Il est très important que le pH de la solution colorante se situe entre 7,0 et 7,2; qu’un contrôle de qualité soit utilisé pour la coloration. La coloration de Giemsa est une coloration oxydative. L’oxygène contenu dans l’eau initie la réaction et par conséquent, après une journée, notre solution de coloration doit être changée.

42
Q

POUR LES GRANULATIONS MÉTACHROMATIQUES OU CORPS DE BABES DE CERTAINES ESPÈCES DE CORYNEBACTERIUM
3 Colorations?

A

COLORATION D’ERNST-NEISSER
COLORATION D’ALBERT
COLORATION DE LOEFFLER

43
Q

ÉTAPË COLORATION D’ERNST-NEISSER

Les granulations forment une combinaison stable avec le bleu acétique sous l’effet de la chaleur.

A
  1. Fixer la lame à la chaleur
  2. Recouvrir la lame de bleu acétique 10 minutes
  3. Laver à l’eau courante
  4. Recouvrir de vésuvine 1 minute
  5. Laver à l’eau, sécher et observer à l’immersion

Les bacilles apparaissent en brun pâle, les granulations métachromatiques se détachent en bleu foncé.

44
Q

ÉTAPE COLORATION D’ALBERT
Les granulations métachromatiques du Corynebacterium diphteriae sont colorées facilement par le bleu de méthylène et apparaissent en bleu foncé.

A
  1. Recouvrir la lame de la Solution 1 pour 5 minutes
  2. Égoutter la lame sans la rincer
  3. Recouvrir la lame de la Solution2 pour 1 minute
  4. Rincer à l’eau courante, sécher+observer à l’immersion

Les granulations métachromatiques se colorent en noir, les bacilles en vert pâle.

Dans certaines espèces de Corynebacterium, les stries sont colorées du vert foncé au noir.

45
Q

ÉTAPE COLORATION DE LOEFFLER
Les granulations métachromatiques du Corynebacterium diphteriae sont colorées facilement par le bleu de méthylène et apparaissent en bleu foncé.

A
  1. Fixer le frottis à la chaleur
  2. Recouvrir la lame de bleu de méthylène à 80%
  3. Rincer à l’eau courante et laisser sécher

Résultats : Granulations bleu foncé

Note :Certaines bactéries comme les Actinomycetes, certaines espèces de streptocoques et d’autres bactéries peuvent morphologiquement ressembler aux Corynebacteries et doivent être différenciées par des cultures et des tests biochimiques.

46
Q

ORANGE D’ACRIDINE
Cette méthode de coloration est principalement utilisée aux hémocultures lorsque l’appareil nous signale une bouteille positive et que le Gram ne démontre aucune bactérie. Il s’agit d’une coloration fluorescente qui pourrait aussi être utilisée pour observer des Trichomonas vaginalis.

A
  1. Laisser sécher la lame à l’air
  2. Placer la lame sur un support à coloration
  3. Fixer la lame au méthanol 50-100% (1-2min)
  4. Laisser sécher la lame à l’air après vous être débarrassé de l’excédent de fixatif
  5. Ajouter l’orange d’acridine sur la lame 2 minutes
  6. Rincer à l’eau courante et permettre de sécher avant d’observer
  7. le spécimen au microscope à fluorescence.
47
Q

CALCOFLUOR

cherche la présence des hyphes/long chemin

A

En mycologie pour l’observation directe des spécimens clinique. Il s’agit d’une coloration non spécifique au fluorochrome, pour la détection rapide des éléments fongiques. Les éléments fongiques apparaîtront vert pomme brillant fluorescent. Les débris ou le tissu peut apparaître jaune vert brillant. La morphologie des cellules tissulaires et des éléments fongiques vont aider à les distinguer les uns des autres.

48
Q

CALCOFLUOR
(cherche la présence des hyphes/long chemin)

Squames, cheveux, ongles**
Tissus autres que pulmonaires
Liquides biologiques (autre que respiratoire)

A
  1. Une goutte de KOH 10% sur une lame propre
  2. ajouter une petite portion de spécimen et émulsifier dans le KOH 10% (le matériel dur et solide peut prendre plus de temps à se dissoudre)
  3. Une goutte de réactif “calcofluor white” et mélanger
  4. Disposer une lamelle no.1 sur la préparation et appuyer délicatement
  5. Sous le microscope UV avec le filtre G (filtre #3)
  6. toujours faire un contrôle de qualité à chaque utilisation

Contrôle positif: Suspension de Candida albicans dans une goutte d’eau distillée +une goutte de calcofluor white
Contrôle négatif:goutte de (KOH 10% + calcofluor white)

Présence ou absence d’hyphes (MCFP, MCFN)

49
Q

FUNGI-FLUOR

Cherche des hyphes et levures de champignon. Rare positif.

RT Normalement infection pulmonaire

A

En mycologie pour l’observation directe des spécimens clinique provenant du système respiratoire. Les chaines polysaccharides B présentes dans la cellulose et la chitine retrouvée dans les parois de la cellule fongique sont colorés par le colorant fluorescent et fungi-fluor. Lorsqu’examinés au microscope à fluorescence, les éléments fongiques seront .

50
Q

ÉTAPE FUNGI-FLUOR

A
  1. Laisser sécher les lames à l’air
  2. fixer la lame avec du méthanol absolu pendant 5 minutes, ou jusqu’à évaporation complète du méthanol
  3. ajouter une goutte de Fungi-Fluor, attendre une minute
  4. rincer délicatement avec de l’eau distillée
  5. mettre le contre-colorant solution B
  6. rincer délicatement à l’eau
  7. mettre une lamelle sur la lame mouillée et examiner au microscope à fluorescence avec le filtre “G”. S’il y a un délai entre le montage de la lame et la lecture de celle-ci, ajouter de l’eau sous la lamelle avant de lire la lame.
  8. Utiliser l’objectif 20x ou 40x.

Contrôle positif: Lame de Candida albicans
Périodiquement, une lame contenant du Pneumocystis carinii et une lame contenant des hyphes devrait être incluse lors de la coloration.

Résultat: Le matériel fongique apparaitra comme une coloration périphérique avec une morphologie caractéristique

Microbiologie (3 decks)

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