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Génétique moléculaire > Chapitre 14 : épissage de l'ARN > Flashcards

Chapitre 14 : épissage de l'ARN Flashcards

1
Q

Comment ont été découverts les introns?

A
  1. ADN coupé avec enzyme de restriction
  2. ADN est mis avec son ARNm correspondant
  3. On incube, donc 1 brin d’ADN se désapparie et est remplacé par ARN

Résultat: régions “boucles” de l’ADN qui prouvent la présence de séquences/structures de l’ADN qui ne se trouvent pas dans l’ARN (introns)

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2
Q

Qu’est-ce que l’ARN pré-messager et un synonme?

A

ARNm avant épissage.

Synonyme: transcrit primaire

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3
Q

Vrai ou faux: un exon est toute séquence de l’ARNm

A

Vrai

L’ARNm contient aussi des régions non-codantes mais tout de même importantes (séquences régulatrices), donc qui ne sont PAS des introns, mais bien des exons

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4
Q

Décrire la fréquence et la taille des introns.

A

Pourcentage fréquence varie selon espèce (en général, plus on monte dans l’évolution, plus le nb d’introns par gène est élevé)

Taille TRÈS variable (environ 60 à 800 000 pb)

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5
Q

Quelles sont les principales régions de l’intron?

A
  1. Sites d’épissage (ici ce sont les séquences reconnues par spliceosome majeur):
    - GU vers le 5’ de l’intron
    - AG vers le 3’ de l’intron
2. Séquence consensus
YNYURAY
-A est le point de branchement près de 3'
-précède région riche en pyrimidine (Y)
-N est n'importe quelle base
-Y = pyrimidine
-R = purine
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6
Q

Quelles sont les réactions chimiques principales lors de l’épissage?

A
  1. Première transestérification
    - le OH-2’ du point branchement (A) fait attaque nucléophile sur groupement phosphate du G au 5’ de l’intron = brise lien phosphodiester
    - formation du lasso
  2. Deuxième transestérification:
    - le OH-3’ de l’exon 1 (celui libéré) attaque le groupement phosphate 5’ du 2e exon, donc:
    - excision de l’intron
    - union des 2 exons
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7
Q

Vrai ou faux: l’épissage recquiert de l’ATP

A

Vrai

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8
Q

Décrire la machinerie de l’épissage.

A

L’épissage a lieu dans une particule de 45S appelée spliceosome composée de:

  • environ 150 protéines et 5 ARN (donc assez volumineuse)
  • snRNP (small nuclear ribonucleoproteins)
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9
Q

Vrai ou faux: les bactéries ont un grand ratio d’introns

A

Faux, les procaryotes ont un génome très condensé qui ne contient pas d’introns

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10
Q

Quelles sont les grandes étapes de l’épissage?

A
  1. Passage du complexe initial (E pour early) au complexe A
  2. Passage du complexe A au complexe B
  3. Passage du complexe B au complexe C
  4. 1ère réaction de transestérification
  5. 2e réaction de transestérification
  6. Libération de l’intro sous forme de lasso et fusion des 2 exons
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11
Q

Expliquer la 1ère étape (passe du complexe E à A)

A

Formation du complexe E:

  1. U1 reconnaît site 5’ de l’intron et se fixe par complémentarité de bases
  2. U2AF et ses 2 sous-unités (U2AF65 et 35) se lient à la région riche en pyrimidines
  3. BBP (protéine et non snRNP) se lie au pt de branchement

Transfo pour complexe A:

  1. Départ BBP
  2. U2 le remplace sur le pt de branchement, donc:
  3. Extrusion de A (n’est plus apparié et est donc libre)
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12
Q

Expliquer la 2e étape (complexe A à B) de l’épissage.

A

Grâce à U1 et U2, il y a recrutement du complexe formé par U6, U4 et U5

  • donc perte de U2AF (ses 2 sous-unités)
  • complexe courbe l’ARNpm et rapproche dont le pt de branchement au site d’épissage
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13
Q

Expliquer la 3e étape de l’épissage (passage du complexe B à C)

A
  1. U6 remplace U1 au site 5’ (U1 est éjecté)

2. U4 est éjecté: U2 et U6 viennent se placer côte à côte et forment donc le site catalytique

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14
Q

Qu’est-ce qu’un rybosime?

A

De l’ARN ayant une activité enzymatique.

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15
Q

Décrire le site actif du spliceosome et l’impact de sa composition.

A

Il est composé d’ARN, malgré que le spliceosome soit une enzyme

Impact: comme il est formé grâce à l’appariement de bases, les erreurs sont très minimes

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16
Q

Quels sont les différents types d’ARN épissés?

A
  1. ARN pré-messagers nucléaires
    - les plus communs
    - mécanisme comme qu’on a vu
  2. Introns du groupe II
    - quelques gènes d’organites et pour procaryotes
    - même mécanisme que pour ARN pré-messager, mais pas spliceosome majeur (auto-épissage par leur activité ribosime)
  3. Introns du groupe I
    - certains ARN ribosomiques nucléaires dans quelques eucaryotes, organites et procaryotes
    - mécanisme: même chose, mais pt de branchement est un G (pas un A) et pas de spliceosome (auto-épissage…)
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17
Q

Expliquer le mécanisme d’épissage du groupe II d’introns

A

Mêmes étapes que pour les ARNpm, mais SANS les facteurs protéiques: auto-épissage (grâce à activité ribozyme)

Donc, dans le groupe II toute la séquence de l’intron est importante pour son épissage, car doit former une structure spécifique

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18
Q

Expliquer le mécanisme d’épissage du groupe I d’introns

A

Pas de formation d’un lasso, mais formation d’une “poche à guanine libre” (pas de A)

  1. 3’-OH du G libre fait liaison phosphodiester avec 5’ de l’intron
  2. 3’-OH de l’exon 1 (libre) fait liaison phosphodiester avec 5’ de l’exon 2
  3. 3’-OH de l’intron libéré fait liaison phosphodiester avec phosphate du nt (à 5’)

Structure particulière est facilitée par protéines stabilisatrices qui gardent le bon repliement, sinon l’ADN étant négatif (à cause des groupements phosphates), il se repousserait lui-même

In vitro: on remplace prots par sels pour neutraliser ces charges

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19
Q

Quelles seraient les origines du spliceosome?

A

On croit qu’autrefois plusieurs fonctions catalytiques étaient effectuées par des ribozymes et qu’elles ont été lentement remplacées par protéines (enzymes) au cours de l’évolution, sauf pour le spliceosome.

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20
Q

Quelle est la cause des erreurs dans la reconnaissance des sites d’épissage?

A

Taille des introns est très grande (jusqu’à 800 000 pb) comparativement à celle des exons (150 pb) donc erreur dans reconnaissance des sites d’épissage seraient fréquentes si snRNP n’étaient pas assistés

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21
Q

Quels sont les 2 types d’erreurs?

A
  1. Non-reconnaissance d’un site d’épissage 3’ (excision involontaire d’un exon)
  2. Reconnaissance d’une séquence qui n’est pas un site d’épissage (un pseudo site)
22
Q

Quels sont les 2 mécanismes assurant la fidélité de l’épissage?

A
  1. Facteurs associés au domaine CTD de l’ARN pol II

2. Protéines SR

23
Q

Expliquer le mécanisme des facteurs associés au domaine CTD de l’ARN pol II

A

Ils reconnaissent sites 5’ et 3’ (co-transcriptionnel: simultané à la transcription)

24
Q

Expliquer le mécanisme lié aux protéines SR

A

Composition: un domaine de liaison à l’ARN et un domaine RS

  1. protéines SR reconnaissent des séquences dans les exons (ESE pour exonic sequence enhancers, soit amplificateur exonique)
  2. séquences recrutent complexe U2AF du spliceosome sur 3’ de l’intron et U1 sur 5’

Donc cela assure que les sites sont les bons

25
Q

Qu’est-ce que le trans-épissage et 1 exemple?

A

Épissage entre 2 ARN différents

  • donne un branchement en Y
  • survient souvent quand plus d’un gène est nécessaire pour coder 1 prot
  • utilise mêmes snRNP que spliceosome majeur, sauf particule U1 (pas nécessaire)

Exemple: trypanosome (parasite maladie du sommeil)

26
Q

Quelle est la différence de l’épissage avec spliceosome mineur?

A

Méthode d’épissage utilisée seulement pour quelques ARNm (p.ex environ 1/1000 pour les humains)

Même mécanisme chimique, mais reconnaissance de sites différents:

  • AU à 5’
  • AC à 3’

Et U11 et U12 remplacent U1 et U2.

27
Q

Quel serait l’ordre d’apparition des voies d’épissage dans l’évolution?

A

On croit que:

  1. introns du groupe II (beaucoup moins complexe)
  2. spliceosome mineur
  3. spliceosome majeur
28
Q

Qu’est-ce l’épissage alternatif?

A

Production de plusieurs alternatives (isoformes) dans le but de créer plus de variabilité à partir d’un seul ARNm

Des isoformes se ressemblent dans leur séquence (proviennent du même transcrit primaire), mais diffèrent dans leur structure et leur fonction

29
Q

Quelle est la fréquence de l’épissage alternatif chez l’humain?

A

Environ 90% des gènes humains subissent l’épissage alternatif.

30
Q

Donner un exemple d’épissage alternatif

A

Gène de la troponine T produit soit:

  • alpha-troponine T (dans muscle des adultes)
  • ou beta-troponine T (dans muscles des nouveaux-nés)

selon l’exon qu’ils ont

31
Q

De quelles manières l’épissage alternatif peut-il être produit?

A
  1. Épissage normal
  2. Saut volontaire d’un exon
  3. Extension d’un exon par épissage interne d’un intron (une partie est incluse dans ARNm mature)
  4. Absence d’épissage d’un intron (un intron complet est inclus)
  5. Exclusion mutuelle de certains exons (présence d’un exon empêche l’autre alors production des 2 possibilités)
32
Q

Donner un exemple d’épissage alternatif avec un exon étendu.

A

Gène codant pour l’antigène T du virus SV40 donne 2 isoformes:

  • forme t: site d’épissage utilisé est placé avant le codon stop, donc prot produite est petite
  • forme T: site d’épissage utilisé n’inclut pas le codon stop, donc protéine produite plus grande
33
Q

Quel type d’épissage alternatif est le plus fréquent?

A

La présence/l’absence d’un exon complet (comme Troponine T)

Exclusion mutuelle: 10% des cas

34
Q

Quels sont les mécanismes menant à l’exclusion mutuelle dans l’épissage alternatif?

A
  1. Encombrement stérique
  2. Site d’épissage pour le spliceosome majeur ET le spliceosome mineur
  3. Dégradation des ARNm avec un codon stop interne (NMD: nonsense-mediated decay)
35
Q

Expliquer le mécanisme de l’encombrement stérique.

A

Présence de U1 au site 5’ de l’intron 2 empêche U2 de se lier au point de branchement du même intron

OU

Présence de U2 au point de branchement de l’intron 2 empêche U1 de se fixer au site 5’ du même intron

Arrive souvent quand intron est trop petit (sites d’épissage trop rapprochés)

36
Q

Expliquer le mécanisme de combinaison des sites d’épissage pour le spliceosome majeur et le mineur.

A

Lorsqu’un intron est composé d’un site 5’ mineur/majeur et d’un site 3’ opposé, cela amène exclusion mutuelle.

Rappel sites de reconnaissance:

  • AU et AC pour mineur
  • GU et AG pour majeur
37
Q

Expliquer le mécanisme de dégradation des ARNm avec un codon stop interne

A

Toutes les combinaisons sont produites, mais ceux qui ont 2 codons stop sont dégradés par RNase qui les reconnaît

38
Q

Que se passe-t-il quand il y a beaucoup de possibilités d’épissage alternatif pour 1 exon? Donner un exemple.

A

Pour certains gènes, il y a plusieurs possibilités p.ex pour le gène Dscam de la drosophile (3816 isoformes), plus particulièrement les gènes 4,6 et 9

Ne peut pas utiliser les mêmes mécansismes:

  • encombrement stérique n’explique pas le cas des exons éloignés
  • pas de spliceosome mineur donc pas le 2e mécanisme
  • NDM ne s’applique pas

Donc, ils utilisent un autre mécanisme pour faciliter épissage.

39
Q

Quel mécanisme d’épissage est donc utilisé pour un exon à grand nombre de possibilités?

A

P.ex exon 6 du gène Dscam de la drosophile:

Possède une séquence d’ancrage (docking site) entre exon 5 et 1er variant de 6 (1 seul docking site) qui s’apparie avec séquence sélectrice (qui varie pour chaque possibilité).

Cela protège 1 seule possibilité de l’exon 6 en la rapprochant du 5 (s’assure que cette variante sera choisie) et en empêchant mécanisme de répression (prot Hrp36)

40
Q

Quelles autres séquences régulent aussi l’épissage alternatif par leur présence/absence?

A
  1. amplificateurs d’épissage (liés soit à intron ou exon)
  2. répresseurs (liés soit à exon ou intron, font partie des prots SR, mais sans domaine RS donc ne peuvent pas recruter la machinerie d’épissage)
  3. activateurs (font partie de la famille des prots SR)
41
Q

Que se passe-t-il avec l’épissage régulé avec un activateur?

A

Parfois, en son absence l’épissage est impossible.

42
Q

Donner un exemple de compétition entre activateur et répresseur d’épissage.

A

Gène Tat du virus VIH

Une protéine inhibitrice se lie au site inhibiteur, se polymérise jusqu’à recouvrir ESE
DONC, ESE n’est plus dispo pour activateur

Résultat: répression

43
Q

Expliquer l’exemple du gène FOXP1.

A

Ce gène code pour pluripotence (pouvoir des cellules souches de se différencier en d’autres types cellulaires)

Donne 2 isoformes différents:

  1. FOXP1-ES
    - active les gènes liés à la pluripotence
    - inhibe ceux pour différenciation
  2. FOXP1
    - inhibe pluripotence
    - active différenciation
44
Q

Quel est le rôle du brassage des exons?

A

Permer d’encoder nouvelles protéines, de créer diversité.

45
Q

Quelles sont les 2 hypothèses par rapport à l’apparition des introns?

A
  1. Introns early model
    Ils auraient été perdus chez les bactéries (pression sélective pour avoir génome plus condensé)
  2. Introns n’auraient jamais été présents dans bactéries, mais seraient apparus dans évolution (insérés)
46
Q

Quelles sont les 3 observations suggérant que les introns ont favorisé l’évolution?

A

La présence d’introns entraîne l’obligation de les enlever = création de plusieurs possibilités (épissage alternatif) ET une telle séparation entre exons permet le brassage d’exons

  1. Séparation des exons représentent souvent des domaines protéines ayant une fonction unique
  2. Plusieurs gènes ont évolué par la duplication d’exons (plus susceptible de se produire avec introns qui les séparent)
  3. Plusieurs exons très similaires se trouvent dans gènes différents et codant pour prots aux fx très variées (exons réutilisés, soit brassage d’exons)
47
Q

Quels sont les 2 types de modification post-transcriptionnelles des ARNm?

A
  1. Modification par substitution (désamination)

2. Ajout ou délétion d’uracile

48
Q

Expliquer la désamination + un exemple.

A

Enlever le groupement amine d’un C = donne un U

Exemple:
Pour l’apolipoprotéine B, cela crée un codon-stop et donc 2 isoformes différents

49
Q

Expliquer l’addition d’uracile + un exemple.

A
  • ajout de U change cadre de lecture
  • insérés par un ARN guide

Fonctionnement:

  1. ARN guide s’apparie avec ARNpm
  2. au site où il n’y a pas d’appariement, une endonucléase clive l’ARNm
  3. ajout des U sur les extrémités clivées de l’ARN par uridylyl transférase terminale (TUTase)
  4. ARN ligase relie 2 fragments clivés de l’ARN

Exemple:
Chez le trypanosome, l’addition d’uracile sur plusieurs ARNm est essentielle pour protéines viables.

50
Q

Comment fonctionne le transport des ARNm?

A

Doit sortir du noyau, car traduction se fait dans le cytoplasme.

Exclusif aux eucaryote (proc n’ont pas de noyau)

  • mécanisme actif (nécessite énergie)
  • certaines prots de liaison de l’ARNm ont signaux spécifiques (pour bien transporter ARNm et non autres types d’ARN ou des introns libérés p.ex)
51
Q

Quels sont donc les 3rôles des snRNP?

A
  1. Reconnaître sites d’épissage
  2. Approcher ces sites ensemble
  3. Réactions catalytiques (cliver et joindre).
52
Q

Quels sont les rôles des protéines DEAD-box?

A
  1. Aident dans catalyse réactions d’épissage: elles ont une activité hélicase, donc peuvent désassembler ARN-ADN
  2. Elles jouent aussi un rôle dans déplacements/ réarrangements/ désassemblage du splicesome (p.ex retirent le spliceosome quand terminé)

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