Ch 7.2 Flashcards
Que permet le clonage moléculaire?
- d’amplifier et de conserver un fragment d’ADN (banques / librairies d’ADN)
- d’exprimer une séquence d’ADN d’intérêt
- d’introduire un gène dans une cellule ou un organisme
- de produire une protéine d’intérêt (protéine recombinante)
Nommer les 3 types de banques d’ADN et leur définition
1-Banque génomique: Banque couvrant l’ensemble du génome.
2-Banque d’ADN complémentaire ou ADNc: Banque constituée d’ADNc, qui ne représentent pas nécessairement la totalité des ARNm. Il s’agit plutôt d’une banque fabriquée à partir uniquement des régions transcrites du génome.
3-Banque d’expression: Banque dans laquelle le vecteur porte des signaux
transcriptionnels permettant à n’importe quel insert cloné de produire un ARNm et en dernier lieu, une protéine.
Quels sont les vecteurs avec lesquels ont fait des banques?
Chromosome artificiel bactérieur (BAC)
Quelles ont les étapes pour former une banque de BACs?
1) Mélange et ligation
2) Transformation par des bactérie
3) Étalement sur boîte de Pétri sur milieu sélectif-
4) Tri de colonies blanches par Q-blot
La démarche est-elle différente si digestion incomplète des inserts par enzyme de restiction ou vesteur linéarisé par la même enzyme de restriction ? pour banque?
OUI
Faut-il autant de molécules recombinantes pour avoir une bonne probabilité de trouver un gène donné? E. Coli vs Homo sapiens
Non! dépend de la taille du génôme! - Humain : 3G bp donc N=6,9x10^5 recombinants - E. Coli : 4,6M bp N=1,1x10^3 recombinants
Pourquoi souhaite-on étudier exprimer l’expression d’une séquence d’ADN d’intérêt comme un gène (via clonage)?
A. pour étudier son expression (séquences régulatrices comme les promoteurs)
B. Pour produire une protéine d’intérêt (protéine recombinante)
Donner un exemple de l’usage du clonage pour étudier séquences régulatrices comme les promoteurs.
Lac Z: pour l’activité B-galactosidas)
Identification de la zone promoteur minimal (-10 à - 50)
Expliquer pourquoi les cellules d’E. Coli utilisées dans les fermenteurs de production de protéines à l’échelle industrielle meurent). Expliquer comment contourner ce problème
- avec un fort taux de CROISSANCE et une synthèse très importante des protéines recombinantes, les cellules meurent rapidement, ce qui limite alors l’expression des protéines recombinantes
- Pour résoudre ce problème : DÉCOUPLAGE entre une phase de croissance (multiplication des bactéries, et donc amplification du gène de la protéine d’intérêt) et une phase d’expression (transcription du gène qui conduira à la synthèse de la protéine)
Expliquer comment on peut utiliser l’opéron lactose pour le clonage?
1) remplacement du gène LacZ par la séquence du gène de la protéine d’intérêt.
2) ITPG, analogue du lactose = se lie au répresseur , l’emêche de se fixer à opéron
3) Activation de la transcprition
4) Protéine recombinante
Comment récupère-t-on les protéines recombinante après leur synthèse?
prots dans cytoplasme bactérie qui a MB
- Sonification : Destruciton mécanique par des ultrasons
- Ajout de détergent (Lyse chimique)
Comment analyse-t-on protéines recombinantes?
- Électrophorèse sur gel polycrylamide
- Western blot après transfert sur membrane
Pourquoi est-il souvent nécessaire de travailler avec cellule eucaryote pour exprmier une séquence d’ADN d’intérêt?
IL ARRIVE QUE
1) La bactérie n’est pas capable d’exprimer un gène eucaryote
2) La bactérie n’est pas capable de fabriquer une protéine eucaryote fonctionnelle (modifications chimiques, repliement …)
Comment appelle-t-on l’équivalent eucaryote de la transformation bactérienne?
Transfection eucaryote
Expliquer la différence entre transfection stable et transitoire
1) Transitoire : l’ADN introduit n’est pas habituellement introduit dans le génome nucléaire: il sera donc perdu au cours de la mitose
2) Stable : l’ADN introduit est intégré au génome et dans ce cas, ce fragment d’ADN va rester présent dans les cellules au cours des division cellulaires
Quel agent est généralement utilisé pour évaluer si pour évaluer la résistance à toxine?
généticine est une toxine neutralisée par le gène de résistance à la néomycine
Quel mécanisme de clonage est à la base de la production d’animaux transgénique?
Transfection eucaryote
Quels sont les critères pour choisir un organisme comme modèle?
1) Vivre en labo et se reproduire (pas trop contraignant : alimentation et influences ext)
2) recherches préalables en dehors génie génétique
3) Reproduction rapide (pour diminuer durée expérience)
4) Modifiable par génie génétique
Donner des exemples et contre-exemples de modèles
Éléphant : massif, nourriture, gestation lente (22mois)
Souris : petite, reproduction rapide.
Nommer les espèces modèles
1) Caernorrhabditis elegans : Ver nématome
2) Mouche du vinaigre (Drosophilia melanogaster)
3) Poission zèbre
4) Souris commune (Mus musculus)
Quels sont les intérêts d’utiliser des organismes différents?
1) étudier détail particulier
2) Plus un être vivant est proche d’un autre, plus résutats exp. pourront être transférés (ex.: souris—-homme > ver—-homme
99%) car H et souris 99% matériel génétique commun
Quels sont les modèles animaux les plus précieux?
exploration maladies de l’individu
Caractéristiques de la myodystrophie de Duchenne
1) Maladie héréditaire : atrphie musculaie dès très jeune âge
2) gène codant dystrophine sur chromosome X
(Dystrophine joue rôle formation protéines musculaires)
Quelles sont les trois méthodes pour faire des animaux transgéniques?
1) Knock-out : Inactiver un gène ou partie de gène sélectionné
2) Knock in : modifié gène puis l’introduire dans génome de l’organisme modèle (par recombinaison homologue
3) Transgenèse additive : addition d’une séquence d’ADN dans le génôme avec une intégration au hasard. Expression de ce ou ces gènes chez animal hôte
Pourquoi génétiquement modifier des animaux?
1)Recherche:
étudier la fonction d’un gène
pour créer des modèles de maladies humaines
2)En industrie:
pour la production de protéines
Ex: production de protéine dans le lait de lapine ou de vache
transgénèse IGF1 chez le porc
Que peut-on faire avec des souris transgéniques?
1) Identifier et caractériser les séquences régulatrices d’un gène donné (dans quel tissu? période de développement)
2) Étudier fct gène in vivo (ex cancer)
3) Valider implication mutation donnée dans phénotype mutant (ex.: Souris albinos Cys85)
4) Créer des souris modèles : pour étude des maladies
- pour étude de la fonction d’un type cell
Comment fait-on pour mesurer l’activité d’une séquence régulatrice?
Fusion entre séquences régulatrices étudiées et séquence codante du gène rapporteur et analyse du patron d’expression du géne rapporteur (code pour protéine facilement détectable)
Quelles sont les 3 grandes étapes de la transgénèse chez souris?
1) Introduction du transgène dans le génome de l’organisme hôte
2) Production d’animaux portant le transgène dans leur génome
3) Création d’une lignée murine capable de transmettre le transgène
Quand s’effectue l’introduction d’ADN pour la trasngenèse additive
1) Chez l’embryon en phase pré-implantatoie au stade 1 cellule ou dans les gamètes
2) Dans les lignées de cellules souches embryonnaires ou cellules Embryonnaire souche (ES) (le plus souvent) ou dans des lignées de cellules germinales (très rarement)
Comment s’effectue l’introduction d’ADN pour la trasngenèse additive?
1) micro-injection : emryon stade 1 cellulle
2) infection rétrovirale (embryon 1 cellule ou spermatogonies)
3) électroporation (cellules ES)
4) lipofection (cells ES)
Définition : cellule mutipotentes-unipotentes
Donnent nombre limité de types cellulaires différentes (souche neuronale, spermatogonie)
Définition : cellule souche pluripotente :
Peuvent se différencier en cellules constituant dérivés des 3 feuillets embryonnaires formés au cours gastrulation (méso, endo, ecto)
Définition cellules ES
ES=embryonnaire souche :
cells souches pluripotentes incapable faire des annexes extra-embryonnaires
PEUT DONNER TOUS LES TYPES DE TISSUS
Qu’est-ce que cellule totipotente
Si elle peut de plus participer à la lignée germinale
3 techniques d’introduction trangènes dans souris
1) Dans l’embryon 1 cellule :
- Micro-injection d’ADN
- Infection rétrovirale (onco-retroviruset lentivirus)
- Transposon (Sleeping beauty)
2) Par l’intermédiaire de cellules souches embryonnaires (cellules ES) :
- Électroporation (avec intégration au hasard ou ciblée)
- Lipofection (avec intégration au hasard ou ciblée)
3) Dans les gamètes in vivo et in vitro (très peu utilisée) :
- Spermatozoïdes comme vecteurs d’entrée dans l’ovocyte
- Transduction rétrovirale in vitro de - spermatogonies et réimplantation dans les testicules de mâles infertiles
- Transduction rétrovirale in vivo par microinjection de retrovirus dans des tubules séminifères immatures
Décrire les étapes de la micro-injection d’ADN dans l’embryon au stade 1-cellule
1) Trtmt hormonal souris femelle (superovulation)
2) Accouplement de ces femelles superovulés= 240 oeufs/20 femelles superovulés
3) Prélèvement embryons au stade 1-cell le lendemain matin
4) Microinjection ADN en solution sous forme linéaire dans pronucléus mâle (plus gros que femelle)
5) Transfert immédiat oeufs micro-injectés dans oviducte femelles pseudogestantes (ou in vitro et tansfert stade 2-cell)
Comment rend-t-on es femelles pseudogestantes?
Conpulation avec mâles vasectomiss
La microinjection d’ADN est la pméthode la plus utilisée car elle fonctionne sur plusieurs mamifères, a un rendement supérieur à 75%, est facile à utiliser, peu coûteuse et permet d’injecter toute taille e séquence
Faux
- rendement : plus de l’ordre de 3-10%
- Technique complexe
- coût élevé
DE PLUS
- Intégration fréquemment à l’origine de réarrangements, délétions, duplications ou translocations au niveau du site d’insertion
-Site d’insertion du transgène difficilement clonable
- pas applicable pour nombreuses autres espèces
Expliquer le mécanisme d’intégration proposé pour la microinjection d’ADN
introduction transgène—–activités enzymatiques—-cassure ADNdouble-brin génôme embryon—–cassure=site intégration
Quel est le principale inconvénient de la microinjection?
Mais surtout:
Cette technique n’est pas applicable pour de nombreuses autres espèces animales y compris le rat par exemple
Expliquer le principe du transfert d’ADN dans cellules souches embryonnaires
1) Cellules souches embryonnaires en culture isolées à partir de masse interne embryon au stade blastocyte
2) Gardent totipotence = toutes les cellules y compris cells germinales
3) Modification génétique in vitro (électroporation et infection rétrovirale)
4) Injectées dans blastocyte réimplanté dans femelle pseudogestante 5) Développement souris chimère (partie ou toutes cells germinales dérivent cells ES modifiées.
6) Lignée
Quels sont les avantages et les inconvénients du transfert de’ADN dans cells souches embryonnaires?
AVANTAGES :
1) Sélection possible in vitro clones des cells ES
2) Méthode permettant transgenèse ciblée (intégration transgène dans un locus choisi au préalable)
INCONVÉNIENTS
1) Procédure très longue
2) Transgène doit comporter un gène de sélection qu’il est ensuite préférable d’éliminer
Expliquer principe de l’infection virale
1) Gène à introduire cloné dans rétrovirus modifié
2) La ou les cells dans lequel gène doit être introduit mis en contact avec milieu de culture des cellules transduites pour le rétrovirus
Quels sont les deux principaux rétrovirus utilisés
1) Oncovirus infecte juste cells en division mitotique
- Silençage—absence complète expression transgène
2) Lentivirus (+ utilisée)
- Infecte cells mitotiques et post-mitotiques
- Pas effet silençage
Mécanisme infection virale
1) Une seule copie insérée à un site donné
2) Pas de réarrangement du génôme hôte, à part une petite duplication
Avantages et inconvénients infection rétrovirale
AVANT
1) + efficace que mcro-injection
2) Peu coûte
3) Manoeuvre plus facile
4) D’autres espèces animales
5)clonage site insertion du transgène aisé
6) Potentiellement utilisation pour crblage grande échelle
DÉSAVANT
1) Seulement pour courtes séquences (10kb)
2) Nature séquences peut diminuer titres viraux
3) Nombre d’intégrtaiton difficilement contrôlables DONC Établissement lignées pure difficile
Pourquoi est-il important d’identifier les individus ayant transgène hétérozygote?
Pour maintenir lignée pure (croisement avec Tg/+ avec +/+)
Après 10 générations on peut croiser Tg/+ et Tg/+
puis ensuite Tg/tg avec Tg/Tg
Comment expliquer que parfois, le transgène n’est pas transmis de façon mendélienne?
<50% : intégration gène effectuée plus tardivement qu’au stade 1 cellule (ex. stade 2 cell)
>50% : intégration transgène dans au moins deux régions distinctes
Décrire effet de position
Important de voir si profil d’expression est bien dû aux séquences présentes dans le transgène ou à un effet de position
Décrire effet nombre de copies
Silençage des transgènes
Pourquoi utiliser un transgène ciblé?
- Région neutres et permissives empêchent effet position et nombre
- Permet comparaison de différents transgènes
Sur quoi est basé transgenèse ciblée?
est basée sur l’utilisation de cellules ES modifiées génétiquement par recombinaison homologue.
Nommer les 3 mutation possibles avec la transgenèse ciblée
- Mutation nulle (Knock-out) : on supprime l’expression définitivement
- Mutation fine (knock-in): on active l’expression d’un gène de manière constitutive
- Mutation conditionnelle (Conditionalknock-out) : on supprime l’expression du gène dans des situations précises (type cellulaire/moment précis du développement)
Pour l’étude de quelles maladies utilise-t-on des souris modèles?
- Trisomie 21 (effet de dose)
- Cération de souris sensibles au virus polimyélite
- Modèles en cancérologie
Exemple de l’utilisation du gène rapporteur
- Gène LacZ (B-galactosidase, E Coli) =X-Gal (substrat, hydrolyse = bleu)
- Gène codant pour GFP (green fluorescent protein) méduse +=absorbe lumière bleue et émet flurorescence verte
Quel est l’intérêt de l’utisation de la souris nude?
- Absence de thymus donc diminution syst immunitaire et Lymphocytes T
- mutation famille FOXO
- induction tumeurs très faciles
- Aucun rejet greffe
