cellbiologi (Avsnitt 1,2,3) Flashcards
1
Q
De olika spottkörtlar och deras egenskaper
A
1- glandula parotis - öronspotkötln= -största spottkörtlen
- körtlent utförsgång -belägen på utsidan av m. masseter
- mynnar på kinndens insiden
- seriöst sekret (unstimulated: 30% /stimulated: 35% )
2- glandula submandibularis - underkäksspotkötln = - ligger i vinkel mellan underkäken och munbotten
- den ligger djupt under munbottenmusklnut
- mynningen syns vid sidan av tungbandets bas
-blandat, både seriöst och muköst (unstimulated: 50%/stimulated: 50% )
3- glandula sublingualis - undertungaspotkötln= - den minsta
- belägen under menbottens slemhinna och övan för munbottensmuskel
- mynnar på ett slemhinnveck under tungan
-blandat, seriöst och muköst (unstimulated: 10% /stimulated: 10% )
2
Q
Normal - Resting saliva/Stimulated saliva
A
Resting saliva: Flow 0.3 mL/min
Stimulated saliva: Flow 1.8 mL/min
3
Q
Resting (Hypotonic) Saliva
A
- Low HCO3-
- Poor acid buffer
4
Q
Stimulated (Isotonic) Saliva
A
- High HCO3- (> 25 mM)
- Good acid buffer
5
Q
Protection against by Saliva function
A
-Abrasion (due to foreign element) Lubricant Pellicle
-Attrition (due to opposing teeth) Lubricant Pellicle
-Erosion: Pellicle barrier, Saliva dilution and clearance of acid
- Caries: Clearance of acid and sugars
Buffering (phosphate, bicarbonate, proteins) Remineralization (super saturation) pH < 5.5
Ca10(PO4)6(OH)2 —-> 10 Ca2+ + 6 PO43- + 2 OH-
- Soft tissue damage Infections: Mucus lubrication, wound healing Anti-microbial proteins
6
Q
vad är saliv gjord av
A
-Ions = Ca2+ : Supersaturation PO43- : Supersaturation, Buffering HCO3- : Buffering F- : SCN- : Peroxidase system Urea : Biofilm buffring
-Proteins = Amylas : Digestive (starch) Lysozym : Anti-microbial Lactoferrin : Anti-microbial Salivary peroxidase : Enzym Myeloperoxidase : Enzym Agglutinins : Salivary agglutinin/gp-340 Mucins - MUC7 & MUC5B S-IgA: Pattern recognition Mucus, lubrication Anti-microbial
7
Q
nutrians of Saliva
A
- gloucose
- lactate
- puryvate
- urea
- Vitamine & minerals
8
Q
3 Types av bakterier
A
- patogena: obigata —> alltid otrevliga
- oppurtuniska patogen: kroppens immunförsvar är nedsat. som kan då leda till sjukdomar
- mixed species infektions: Bland infektioner
9
Q
microbiol community
A
Microbiol community är grupper av mikroorganismer som delar ett gemensamt boendeutrymme. De mikrobiella populationerna som bildar samhället kan interagera på olika sätt, till exempel som rovdjur och rov eller som symbionter.
10
Q
biofilm
A
- Biofilm uppstår när bakterier fäster till en yta i fuktig miljö genom att utsöndra en tjock, slem- och klisteraktig substans.
- faktorer som gör det lättare att mikroorganismer fastar på ytan och bild biofil är: kapsel, fimbrier,olime
11
Q
pelikel
A
proteiner, lager över tänder, skyddar mott omgivning
12
Q
buffering
A
Saliven är också en sak som fungerar som buffert eftersom munnen ofta utsätts för olika syraattacker från mat eller från magen, och då behöver stabiliseras igen.
13
Q
försvar mekanismer
A
peroxides/enzym skyddas maltsyra i munhålan. hämmar syra prodektion hos streptokocker
14
Q
platsen där batterier kan samlas
A
- Munhålan –> pelikel –> comelsalema ( vanlig/ofarliga bakterier) –> sekundära (orsakar problem/ patogena)–> dålig omsättning –> “platserna är (sub/supra) gingivalt och crypts” –> aerobabakterier: växter utan syre.
PLUS- Bakterier blir aeroba som då leder till dålig andedräkt. olika bakterier har olika syror
15
Q
EMALJ!
A
hydroxyapatit: Ca10(PO4)6(OH)2
fluorapatit: Ca5(PO4)3F
16
Q
Homeostas
A
- reglering av interna miljön
(betyder: måste avgränsa interna miljön från omvärlden) - för att upprätthålla homeostas behövs energi utifrån (betyder: ämnesomsättning/metabolism)
17
Q
Reproduktion
A
Reproduktion, förmågan att skapa nya “enheter” (organismer) genom delning eller befruktning
18
Q
Två fundamentalt olika designkoncept för celler: eukaryoter och prokaryoter
A
- prokaryoter: (domäner: Bacteria och Archaea) =
- ingen cellkärna
- inga/få uppdelningar av cellens interiör
- en gen har sammanhängande sekvens
- ofta (inte alltid) unicellulära - eukaryoter: (domän: Eukarya) =
- cellkärna som innesluter DNAt
- relaterade fuktioner ofta avgränsade i organeller
- gener innehåller ofta introner
- ofta (inte alltid) multicellulära
19
Q
Vad är lika mellan prokaryoter och eukaryoter?
A
Trots att celler kan vara extremt olika till utseende och storlek är alla levande celler baserade på samma kemi intracellulärt
Alla celler innehåller genetisk information som kodar för proteiner
20
Q
Livets kemi: byggstenar: nukleinsyra
A
-DNA dubbelhelix
Adenin (A) basparar alltid med Tymin (T). Guanin (G) basparar alltid med Cytosin (C).
Detta är den kemiska principen bakom DNAs replikation, och därför för livets fortplantning på jorden.
-DNA dubbelhelix i mer detajl
“Sidorna” av dubbelhelixen består av sockermolekyler (deoxyribos) ihoplänkade med fosfatgrupper (i figuren kallat “phosphate-deoxyribose backbone”)
A, C, T och G kallas kvävebaser.
Eftersom A och G (“puriner”) som är större alltid basparar med de mindre C och T (“pyrimidiner”) blir helixens diameter alltid lika stor
Vätebindningar håller ihop de två strängarna strängarna (2 mellan A-T, 3 mellan G-C)
-DNA dubbelhelix i 3D
Varje varv innehåller 10 baspar
Det finns en major groove och en minor groove i helixen (“stor fåra” resp “liten fåra”)
DNA-helixens utsida är negativt laddat pga fosfatgrupperna och gör att katjoner eller positivt laddade proteiner gärna binder till DNA
Vanligaste 3D-konformationen av DNA kallas “B-DNA”
21
Q
Centrala dogmat
A
-Replikation: den cellulära processen då DNA:t kopieras.
Byggstenarna är dNTP (dATP, dGTP, dCTP och dTTP) sätts ihop till deoxyribonukleinsyra (DNA). Dessutom krävs enzymet DNA-polymeras. Hela processen kräver många ytterligare proteiner och enzymer
-Transkription: den process som översätter DNA till mRNA med enzymet RNA- polymeras och nukleotiderna AUCG till ribonukleinsyra (RNA).
mRNA kallas meddelande-RNA och fungerar som en mall för proteinsyntes.
Alla gener översätts inte till mRNA i alla celler och ibland gör cellen olika mängder
-Translation: den process då mRNA med hjälp av tRNA översätts till aminosyrasekvens (polypeptid/protein). Sker i ribosomerna (rRNA)
22
Q
Livets kemi: byggstenar: kolhydrater (CH2O)n
A
- Isomerer: Ex monosackariderna glukos och galaktos har samma kemiska formel C6H12O6 men bindningarna mellan atomerna har olika riktning vilket kan ha stor biologisk betydelse.
- Monosackarider kopplas ihop med varandra, och sätts på andra molekyler.
- Proteoglykaner: (kolhydrater kopplade till proteiner)
- Polysackarider: stärkelse, cellulosa (liten kemisk skillnad mellan stärkelse och cellulosa gör stor skillnad)
- Disackarider: skars, laktos, maltos
23
Q
Livets kemi: byggstenar: lipider
A
Lipider är ett samlingsnamn på relativs stora, kolväten som är svårlösliga i vatten.
T ex fetter, fettsyror (karboxylsyror), fosfolipider, steroider.
24
Q
Fosfolipider
A
Fosfolipider är en grupp av fetter som tillsammans med en mindre mängd kolesterol bygger upp cellernas membran. Fosfolipider är uppbyggda av ett polärt, hydrofilt, huvud och en opolär, hydrofob, svans. Det betyder förenklat att huvudet är vattenlösligt och svansen fettlöslig.
25
Livets kemi: byggstenar: proteiner
Proteiner är organiska ämnen med hög molekylvikt. Tillsammans med polysackarider, fetter och nukleinsyror utgör proteinerna huvudbeståndsdelen i allt levande. Ett äldre namn är äggviteämnen. Kemiskt består proteinerna av långa kedjor av aminosyror hopbundna genom peptidbindningar. 20 olika aminosyror (olika sidokedjor). Aminosyror länkas samman till polypeptider genom en peptidbindning.
26
Why should we learn about amino acids?
• Amino acids are protein building blocks. If we know their properties, we can understand and even predict how proteins will fold and function.
• Amino acids are important metabolites:
- because they are needed for protein synthesis
- they are starting materials for other metabolites, e.g. nucleic acid bases
- they are intermediates in metabolic pathways
- several are “essential” - human body can’t make them
27
From Amino Acid Sequence to Protein Function
* You should know the amino acids general structure and properties.
* Understand the characteristics of the peptide bond.
* What is protein primary, secondary and tertiary/quaternary structures.
* The factors governing their formation ("protein folding").
* Relation structure - function?
28
How proteins are build up
* Proteins are polymers of amino acids. Amino acids are their building blocks or alphabet. This alphabet contains 20 ”letters”-amino acids
* Shorter than ca. 50 amino acids are peptides, unstructured
* Proteins are polypeptides with very variable length, from kDa to MDa in molecular weight.
29
What are amino acids?
```
(BILD) there are different groups of amigo acids:
• Carboxyl group
• Amino group
• Side-chain group - R
• a-carbon Ca
• Chirality of Ca
```
-Chirality: With the hydrogen atom away from the viewer, if the arrangement
of the CO→R→N groups around Ca as a center is clockwise, then it is
the D form. If anti-clockwise - the L form. Amino acids in proteins are in the L-form. Ca in Gly is not chiral.
-Humans can produce 11 of 20 protein amino acids. The others must be supplied in the food - essential amino acids: phenylalanine, valine, lysine, threonine, tryptophan, methionine, leucine, isoleucine, histidine. Shortage of even 1 essential amino acid results in degradation of body protein —muscle and so forth—to obtain the one amino acid that is needed. Unlike fat and starch, the human body does not store excess amino acids for later use.
30
Amino acid side chains
• The properties of side-chains determine protein structure and function.
```
SIZE
FLEXIBILITY, DYNAMICS
POLARITY CHARGE
pKa
HYDROPHOBICITY OXIDATION/REDUCTION
CHEMICAL MODIFICATIONS
```
31
Chemical properties of amino acids Titration of amino acid without charged side chain:
amino acids act as buffers!
| amino acids with additional ionizable groups -COOH / -NH2 are called acidic / basic amino acids
32
Proteinogenic and non-proteinogenic amino acids
• 20 a amino acids are incorporated into proteins (seleno-Cys can be counted as 21)
• Some of these subject to post-translational modification
• These are all L amino acids
• D amino acids are very rare, occur in antibiotic gramicidin
which is formed by soil bacteria for defense
• Other amino acids are not inserted into proteins, examples:
- -aminobutyric acid: neurotransmitter
QuickTimeTM and a decompressor
are needed to see this picture.
33
Side-chains of amino acids determine role in protein. Therefore: address their chemical properties and which bonds / forces they can generate in protein structure
* Ionic interactions
* Dipole interactions
* Ion-dipole interactions • Hydrogen bonding
* van der Waals force
* Hydrofobic effect
34
Acidic Amino Acids and their Amides
Acidic amino acids are polar and negatively charged at physiological pH. Both acidic amino acids have a second carboxyl group.
Amides are polar and uncharged.
35
Basic Amino Acids
Basic amino acids are positively charged at pH values below their pKa.
Lys has also a long hydrophobic side-chain, it is often located close to protein surface, with the amino group of the side chain in contact with solvent.
Histidine has pKa close to neutral pH important for H+ transfer in enzymes!
36
Charge interactions
- Salt bridge between side-chain COO- of Glu and
side-chain NH + of Lys
• Electrostatic contribution is long-range
• Interaction between equal charges repulsive
• H bonding contribution strongly orientation- dependent!!!
- Charged amino acids can interact with water by: -hydrogen bonds
-dipole binding
-ion dipole binding
They are solvent exposed.
37
Protein charges are important for:
* Interactions with water, buffer, ions etc.
* Interactions with other proteins: Protein-protein binding, quaternary structure, protein aggregation
* Interaction with other biological molecules and structures (cell membranes)
38
Hydroxyl (R-OH) Amino Acids
Hydroxyl amino acids are polar and uncharged at physiological pH.
The phenolic hydroxyl ionizes with a pKa of 10 to yield the phenolate anion. The pKa of hydroxyl groups of serine and threonine are so high that they are generally regarded as nonionizing.
39
Dipole interactions
* A polar molecule has a net dipole (i.e. Having EQUAL partial positive and partial negative charges).
* Dipole-interactions are formed between delocalised electrons. Electrostatic attraction.
* H-bonds are electrostatic attractions between H atoms bound to highly electronegative atoms such as N, O or F and other highly electronegative atoms.
* Van der Waals forces–the residual forces that arise from induced dipoles, e.g. Temporary dipoles of non-polar side chains. Weaker than H-bonds.
40
Aliphatic amino acids
Hydrophobicity increases with increasing number of C atoms in the hydrocarbon chain.
Glycine has such a small side chain that it does not have much effect on the hydrophobic interactions.
Hydrophobic amino acids form hydrophobic core of the proteins. They are buried inside.
41
Hydrophobic effect
Proposed explanation: non-polar solute disrupts H bonding network of water, this disruption is smallest when solute is spherically enclosed
42
Sulfur-containing amino acids
The thiol group of cysteine can react with other thiol groups in an oxidation reaction that yields a disulfide bond.
Cys-Cys bonds are often formed in proteins
-SH group is a weak polar group, but its dipole moment is very small
- Methionine is one of the most hydrophobic amino acids and is almost always found in the interior of proteins.Methionine helps with chelation, which is the removal of heavy metals from the body to ensure that the liver, kidneys, and bladder remain healthy.
43
Proline
When proline is in a peptide bond, it does not have a hydrogen on the α amino group, so it cannot donate a hydrogen bond to stabilize an α helix or a β sheet.
Due to its unique structure, proline occurs in proteins frequently in turns or bends, which are often on the surface.
Can be converted into hydroxyproline (common in collagen) by post- translational modification.
44
Aromatic amino acids
All aromatic amino acids absorb ultraviolet light to different degrees, used for protein analysis.
45
Functional role of amino acid side-chains
• Lysine, Arganin: nucleicacid and proteinbinding
• Glutamin, Aspartic Acid: proteinbinding, acid-basecatalysis, metal
binding – Ca2+, Mg2+, Cu2+ , Na+ , K+ ets
• Proline, Glycin, : bends, flexibility.
• Cystein: stability via disulfide bonds, redox chemistry.
• Cystein: Tyrosin: radical chemistry.
• Aromatic amino acids: photo-sensitivity, hydrophobic stacking.
• Histidin: Acid-base catalysis, metal binding.
• Serine, Thrreonine, Tyrosine: Regulation via phosphorylation.
• Asparagin, Serine, Thrreonine: glycosylation, antigen recognition.
46
Scales of hydrophobicity
Used e.g. to predict transmembran helices: stretch of strongly hydrophobic amino acids.
47
Isoelectric point (PI)
• The isoelectric point (pI) of a protein is the pH at which that protein has no net charge.
Positively charged < pI < Negatively charged
• Characteristic of the protein, gien by balance between acidic
and basic amino acids.
• At pH = PI the solubility of a protein lowest (avoid this pH in order to increase the solubility)
Polypeptider bildas på ribosomen,
48
Polypeptidens struktur
A polypeptide is a chain of amino acids. Amino acids bond together with peptide bonds in order to form a polypeptide. The n-terminal (amino terminal) is located at one end of the polypeptide while the c-terminal (carboxyl terminal) is located at its other end.
49
Peptidbindningen är platt – jämför med en dubbelbindning
* En resonans mellan syre och kväves fria elektronpar gör bindningen svår att vrida
* Detta begränsar dess rörelsefrihet
50
Proteins – from Structure to Function
• Proteins can be soluble, sit in a membrane, or form large structures.
• Most proteins “fold” into defined structures in their functional native states.
• In vitro, small proteins fold spontaneously.
• In vivo, complex processes control that proteins adopt their native states,
their activities,
and their degradation.
• There are about 30000 proteins in the human body.
• Proteins are involved in virtually every function life depends on.
• Proteins change conformation and interact to carry out their function.
51
Examples of protein function
* Enzyme: Lysozyme
* Structural Protein: Collagen
* Transport Protein: Hemoglobin
* Motor Protein: Myosin
* Storage Protein: Ferritin
* Signaling Protein: Calmodulin
* Receptor Protein: Rhodopsin
52
From Amino Acid Sequence to Protein Function
```
• What holds proteins together?
• Levels of protein structure: primary,
secondary,
tertiary,
quaternary
• Classes of protein structures
• How do proteins work?
• Examples: e.g. Membrane proteins
```
53
Organization Layers in protein structure
* Primary structure: Amino acid sequence
* Secondary structure: Alpha-helices, beta-sheets and coils
* Tertiary structure: Three-dimensional protein structure
* Quaternary structure: Dimer or larger complex formation
* Domains: protein parts that independently fold, 50-200 amino acids long, small peptides are unstructured.
* Protein Family: evolutionary related, similar sequence & structure.
54
Common structure of amino acids
• common structure H2N-CH(R)-COOH
• all amino acids in proteins are L forms
• side chain R determines amino acid’s properties CH3 = Ala
CH2COO- = Aspartate
H = Gly is special
55
Bildning av en peptidbindning
Karboxylgruppen och aminogruppen försvinner och bildar en amidbindning – eliminering av vatten!
56
The Peptide Bond
- Explains why there is no rotation around peptide bond.
| - Explains why peptide bonds are normally trans.
57
Polypeptidens struktur
• Polymeravamidbindningenkallas”backbone”
• Aminosyror numreras från ”N-terminalen till C-
terminalen
• SidokedjankallasR-grupp
R differs in properties along the chain, sequence of R defines protein structure & function
58
Secondary Structure Elements: a helix and b sheet
ALL protein structures contain helices (red), and/or b sheets (yellow) and connecting loops.
1. Why are there only these secondary structure elements? 2. Why do these repetitive structural elements exist?
The backbone angles f, y,w determine local structure.
59
Rotation around polypetide backbone bonds: Ramachandran plot
w = almost always trans, no rotation
Secondary structure is defined by two angles around the α-carbon: φ (phi) and ψ (psi). Secondary structure elements are determined by repetitive sterically allowed combinations of f, y.
60
Backbone Conformation: Ramachandran plot
Only certain combinations of f,yoccur–inALLproteins.
| Only these combinations of f, y avoid clashes in repetitive structures.
61
Secondary structure: a helix
α-helix bildas av att en polypeptidkedja viras runt sig själv och bildar en cylinder.
Always right-handed rotation!
N-H donerar en vätebindning till C=O från peptidbindningen 4 aminosyror tidigare, dvs i+4i.
18 aminosyror bildar 5 hela varv på helixen 3.6 aminosyror för ett komplett varv.
Aminosyrornas sidokedjor pekar ut från helixen.
62
Hydrogen bonds
* H bond is a strong dipole bond, where a H is bound between two electronegative atoms.
* X-H group is “donor”, other electronegative atom “acceptor”
* Directional: strongest when X, H, Y are in one line
* Max. 5 kcal/mol (covalent bond ≈ 100 kcal/mol)
63
α-helix
Side chains are outside.
Densely packed structure.
Side-chains determine the hydrophobic or hydrophilic surfaces of α-helix and its interactions with other elements of the secondary structure.
64
Secondary Structure: b-sheet
• a helix, b sheet exist because their H bonds stabilize the structure.
65
Olika sätt att representera proteinstrukturer
Alla representationer visar samma struktur, men med olika nivåer av detaljer
66
Buried and exposed amino acids
* amino acids prefer to be exposed / buried – linked to tertiary structure
* A, C, I, L, M, V, F, W are often buried,
* R, K, are almost never 100% buried,
* other buried or on surface.
67
Tertiary Structure: Hydrophobic effect
Hydrophobic side chains (white) are hidden in the “hydrophobic core”
Charged and polar side chains on the outside.
Burial of hydrophobic side chains ”hydrophobic effect“ stabilizes tertiary structure.
68
What determines 3D structure?
* Backbone conformation defines a helix and b sheet, but not tertiary structure.
* The side chains fill out the hydrophobic core, make soluble, prevent aggregation.
* Long-range interactions, mainly between side chains, stabilize the tertiary structure!
* Each amino acid sequence adopts ONE structure, encodes secondary- and tertiary structure.
* Each fold (arrangement of secondary structure elements) possible with many sequences.
69
Domains of proteins
- Lysozyme: One domain,
a helix and b sheet
- Calmodulin: Two domains, almost only a helix,
central helix flexible
- MyoD: Quaternary Structure of two domains:
- Structural definition: Can fold independently.
-Functional definition: Does a certain job.
70
Protein folds
- Proteinveckning är den process genom vilken ett protein får sin specifika tredimensionella form, i vilken det kan fylla sin funktion. Man skiljer mellan globulära proteiner samt fiber-proteiner. De globulära proteinerna förmedlar cellens funktionalitet, medan ett fibröst protein ofta är ett strukturelement.
• Protein structures can be classified according to:
- Which secondary structures occur?
- How are secondary structures aligned in primary sequence? - How are secondary structures arranged in space?
• Some “folds” occur very often, others are very rare. Tens of thousands of protein structures, a few hundred folds.
• the same protein function can be done by proteins with completely different folds.
• Example from SCOP data base of folds: a+b class:
121 “folds” = different arrangments of a helix & b sheet
Triose phosphate isomerase superfamily: triose phosphate isomerase
RuBisCo (C-terminal domain) superfamily: CO2 fixation in plants
71
TIM barrel fold
* parallel beta-sheet barrel, closed (first and last b strand H bonded) • 8 b strands in same order in primary sequence and structure)
* b strands connected by a helices
72
Kofaktor - Prostetisk grupp
Ibland kräver ett protein extra ”verktyg” för att utföra en speciell funktion. De binder då kofaktorer, molekyler som inte är proteiner.
En typ av kofaktorer är prostetiska grupper.
En prostetisk grupp är starkt, ibland
t.o.m. kovalent bundet till proteinet.
Är nödvändig för proteinets funktion OCH är del av proteinets struktur!
Den prostetiska gruppen kan vara organisk (vitaminer, sockerarter, lipider, mm) eller oorgansik (metalljoner, järn- svavel kluster).
Om en prostetisk grupp förändras vid t.ex. en enzymatisk katalys måste den regenereras på plats.
Myoglobin: heme group for O2 binding
73
Kvartärstruktur
Många proteiner uppnår inte någon funktion förrän de bildar komplex med andra proteiner.
Kvartärstrukturen beskriver hur de olika polypeptiderna (proteinerna) förhåller sig till varandra i komplexet.
Proteinerna i ett kvartärt komplex kallas ofta för ”subunits” (subenheter).
Konformationsförändringar i ett kvartärt komplex kan ske via; (1) konformations- förändring i en eller flera subenheter,
(2) reorientering av subenheterna
Konformationsförändringen i ett kvartärt komplex är grunden till kooperativitet och i vissa fall allosteri.
hemoglobin, a2b2 quaternary structure with 4 heme
74
Triple helix of collagen – quaternary structure
Right-handed bundle of three parallel, left-handed helices of individual collagen peptides.
Gly-X-Y repetitive motif
Structure is stabilised by H- bonds between collagen peptides
75
Protein function: “Induced Fit” Binding
Induced fit kan beskriva hur olika domäner i ett protein reorienteras när det binder sin interaktionspartner.
Induced fit kan beskriva hur en ostrukturerad del (eller helt protein) veckas när den träffar på sin interaktionspartner
76
Enzyme active site - mechanism
Chymotrypsin, hydrolyses peptides
1. active site makes Ser195 more reactive
(pK of side chains often shifted in active site) 2. Good arrangement of all catalytic side chains 3. Substrate gets bound in fitting orientation.
Mutations can influence binding or activity <> mechanism
77
Integral Membrane Protein: Bacterial Porin
.....
78
Porin Structure
Porins are beta barrel proteins that cross a cellular membrane and act as a pore, through which molecules can diffuse. Unlike other membrane transport proteins, porins are large enough to allow passive diffusion, i.e., they act as channels that are specific to different types of molecules.
79
Membrane Protein: K+ Ion Channel
....
80
K+ channel: Mechanism
....
81
Muscle proteins: Myosin moves on Actin
- Actin quaternary structure: polymer of monomers pointing one way:
- --> directional, “polar”
-Myosin: 2 repetitive 1300 aa a-helices (yellow, orange) with headgroups, assembled a helical coiled coil
regular repeat for packing in thick filaments
- Myosin headgroups bind ATP - change conformation, leave actin - hydrolyze ATP - grab actin, release Pi - ADP-ATP cycle starts new
82
Natively unfolded proteins
- Unstructured in free state
- Fold upon binding
- Large fraction of human genome!
83
Summary of terms
• Active site: Part of protein where functional amino acids are arranged
• Coil: unstructured part of a folded protein
• Coiled coil: special tertiary structure of collagen
• Random coil: unfolded state of a protein
• Domain: protein part that folds independently, ~50-200 aa
• Family: proteins related in evolution, similar sequence/structure;
can have structural or functional meaning.
• Fold: 3D arrangement of secondary structures
• Globular structure: ball-like structure of soluble proteins
• Native structure: Functional in vivo structure
• residue: amino acid in protein
• Subunit: Part of a quarternary structure
• turn: (structured) protein part connecting secondary structure elements
• conserved amino acid, conservative mutation, WT
84
Native structure and misfolded structure - prion protein
- Native structure, based on NMR results
- Fibril structure, MODEL based on low- resolution structural studies
- Native structure seems to be most stable structure.
85
Relevance of Protein Folding
- Most proteins must fold to function, why do mostly these occur?
- Stability of folded structure determines protein’s lifetime
- Small changes in structure can strongly influence function: - Single Glu -> Val mutation causes sickle cell anaemia
- misfolding diseases: Alzheimers’, Prion disease, ALS ...
- Astronomical number of possible sequences:
Around 1 million billion times more 50-amino-acid sequences than atoms on Earth, but:
- Few sequences occur,
- many have same “fold” - why?
- Protein production: will it fold?
86
Folding Problem
Small proteins fold spontaneously – amino acid sequence encodes structure!
• What structure does a polypeptide fold into?
H bonds in secondary structures are not sequence-specific!!!
• How does a peptide chain find its fold???
• Unfolded states expose hydrophobic side chains, these can aggregate / precipitation, consequence can be misfolding diseases.
87
Which structure?
• There are 20100 100-amino-acid sequences
probably only a TINY fraction folds, or:
“How will a random sequence fold?” Is wrong question: VERY unlikely it folds
• Amino acid sequences of natural proteins are VERY SPECIAL: SELECTED TO FOLD
• The amino acid sequence encodes the structure, nobody knows the code
• Determine structure experimentally: X-ray crystallography, NMR
• Tens of thousands of structures, just a few hundred folds – secondary structure patterns
88
Energetics: Folding as Chemical Equilibrium
• Many small proteins can fold and unfold reversibly: equilibrium
• In the transition state (TS) bonds form or break:
Here the non-covalent bonds of secondary & tertiary structure
```
• DG=DH–TDS
DG: related to stability DH: heat of reaction,
related to bond energy
DS: change of entropy (”disorder”)
• So what determines DH and DS?
```
89
Entropy & Enthalpy of folding: The protein
-Thermodynamics of folding: DG = DH – TDS
•DH and TDS have contributions from protein AND water
- DH contains: energy of H bonds in secondary structures!! van-der Waals bonds in hydrophobic core: ---> stabilizes N
• folding of random coil into ordered structure reduces
entropy: -TDS OPPOSES folding
• Protein would not fold (without water‘s contribution)
90
Water‘s contribution to folding
• Main effect: Exposed hydrophobic side chains of U molecules
reduce motional freedom of nearby water molecules.
• Folding burries hydrophibic side chains, motional freedom =
entropy of water INCREASES during folding!
• water is involved in folding, its entropy increase stabilizes N
• Stabilization of N due to water’s entropy gain hinges on burial of hydrophobic amino acid side chains.
• Smallest proteins are ~50 amino acids, else no hydrophobic core.
91
HOW do proteins fold? Simple models for folding paths
-Diffusion-collison: secondary structure forms first, then tertiary structure
-Hydrophobic collapse: protein becomes compact first, then secondary structures form
-Nucleation / growth: one secondary structure element forms first, rest attaches to it
- Different intermediates should be observable! Intermediates rarely observed
Natural proteins have evolved against - dangerous - intermediates.
92
Folding funnel
Native-like secondary, tertiary interactions formed from many starting structures.
Most “early” interactions lead towards folded state:
No “traps”
- intermediates - in funnel.
93
Folding in the Cell
* Fundamental interest: Do proteins fold spontaneously in the cell like in vitro?
* If you produce a human protein in bacteria, why does it often not fold?
* Proteins are synthesised in the cytosol. Where does a protein fold that works in a different compartment?
* There are proteins that get translated, fold, get processed. The processed protein will then typically not fold after denaturation, classical example: insulin.
94
The cellular environment:
CROWDED: many possible interactions
95
Co-translational Folding on Ribosome
• Do proteins also fold
spontaneously in the cell?
• ”Trigger factor protects ”nascent chain”
• Domains fold independently
96
Chaperones
* Some proteins don’t fold fast enough to their folded state, although it is more stable.
* Chaperones are proteins that help such proteins fold.
* disulfide isomerases, proline cis-trans isomerases
* Bind unfolded states and prevent them from precipitating.
* Can unfold misfolded states using energy, so that they can fold.
97
Function of GroEL chaperone
GroEL is a protein which belongs to the chaperonin family of molecular chaperones, and is found in many bacteria. It is required for the proper folding of many proteins. To function properly, GroEL requires the lid-like cochaperonin protein complex GroES.
98
Natively unfolded proteins
Natively unfolded or intrinsically unstructured proteins constitute a unique group of the protein kingdom. ... These proteins show a low level of ordered secondary structure and no tightly packed core. They are very flexible, but may adopt relatively rigid conformations in the presence of natural ligands.
99
Native and Amyloid Structures
Amyloids are aggregates of proteins characterised by a fibrillar morphology of 7–13 nm in diameter, a β-sheet secondary structure (known as cross-β) and ability to be stained by particular dyes, such as Congo red. In the human body, amyloids have been linked to the development of various diseases.
100
Why can most proteins form amyloid fibrils?
* Amyloid is stabilized by b sheet & interactions between chains - interactions are not sequence-specific
* Native structure must / cannot be too stable.
101
Prediction of protein structure?
• Structures of similar sequences can be predicted
• Extremely difficult to predict structure of new sequence
• Structure determination routine, prediction tricky!
Computer simulation of small protein structure, here
- local structure statistics for
~5 amino acid stretches
> assemble local structures - select structures with good
packing, secondary structures.
102
Computer analysis of proteins????
Data bases:
- genomes of organisms: deduce amino acid sequences
- pdb: biomolecular structures
- nucleic acid data base
- BMRB: NMR data & structures
Computer programs:
• sequence comparison
• fold recognition: sequence → structure
• prediction of transmembrane helices
• structure determination: X-ray / NMR / EM
• Structure prediction, folding@home: use YOUR computer
• visualization: structures, surface properties, docking
• motions: molecular dynamics simulations
103
Det centrala dogmat-----> - Ritning
Den centrala dogmen inom molekylärbiologin innebär att den genetiska informationen överförs från DNA via RNA till protein. De virus som enbart har RNA och inget DNA var tidigt kända, men även hos dem vandrar informationen åt rätt håll enligt dogmen, från RNA till protein. För att dela sig måste celler duplicera alla sina beståndsdelar
104
Människans DNA-mängd och organisation
* MänniskansDNAäruppdelatikromosomer,tvåav varje sort (diploid)
* 3.2 x109 nukleotidpar
* 2% av totala DNA-sekvensen kodande
* 21.000 proteinkodande-gener
* En cells totalt 2m DNA finns inne i kärnan (6 μm) organiserat som kromatin (DNA+ protein)
* DNA är uppdelat i kromosomer, två kopior (homologer) av varje kromosom (diploid)
* Kromosomerna har nr 1 till 22, + 2 könskromosomer (XX eller XY)= totalt 46 kromosomer
Eukaryota celler har även ett cirkulärt mitokondriellt genom
105
Bakterien E. coli:s genom
```
• Ingenkärna(prokaryot)
• Enkopiaavgenom (haploid)
• CirkulärDNA-molekyl
• 4.6 x106 nukleotidpar
med 4.300 gener
• 90%avDNA-sekvensen kodande
```
106
DNA - uppbyggnad och struktur
Byggstenarna till DNA och RNA syntetiseras i cytoplasman eller tas upp från omgivningen
(se senare föreläsning av Paulina Wanrooij)
DNA består av två stycken antiparallella kedjor av deoxyribonukleotider som bildar en dubbelhelix
107
DNA - uppbyggnad och struktur
-Tre fosfatgrupper
-Fyra olika kvävebaser
I DNA: Adenine Thymine Cytosine Guanine
-N-glukosidbindning
- OBS!! Numrering av kolatomer
-En sockerdel: deoxyribos i DNA
-DNAs baser binder varandra (basparar) via vätebindningar A parar alltid med T och C parar alltid med G
- pyrimidin och purin
-• DNA-syntes sker i 5’- 3’-riktning
• Vid syntes agerar DNAs två strängar mall (templat) för varsin ny sträng
108
Packning av DNA
DNA-tråden är ca 2 meter lång – För att få plats i kärnan (diam ~10 μm) måste tråden packas
Nukleosom: ~140 bp DNA + histon-oktamer 2 st var av (H2A, H2B, H3, H4)
1 histon H1 binder på utsidan av varje nukleosom. Fungerar som brygga mellan nukleosomerna
Leder till bildande av ”30 nm fiber” - Resultat: 40 ggr packning av DNA
C:a 1.000 ggr packning krävs för att humant DNA ska få plats i kärnan.
Vidare packning sker via H1:H1 interaktioner samt mindre utforskade mekanismer
109
Nukleosomens struktur
Nukleosomerna är uppbyggda av ca 147 baspar långt DNA uppvindat runt nukleosomkärnan som består av fyra par (8 st) histonproteiner. ... Den metylerade nukleosomen kan binda till proteiner (HPI) som medierar övergång till den kondenserade, icke aktiva formen: heterokromatin.
110
Hur mycket DNA syntetiserar humana celler?
-----
111
Sammanfattning 2
| DNA:s uppbyggnad och struktur
• Dubbelsträngat: Består av två deoxy-nukleotidkedjor
• De två DNA-strängarna hålls ihop genom vätebindningar mellan de ingående baserna
• A (adenin) basparar med T (tymin)
G (guanin) basparar med C (cytosine)
• DNAs två strängar är antiparallella med varandra och bildar en dubbelspiral (helix)
• Vid DNA-replikation används DNA-strängarna som templat för att bilda varsin ny komplementär sträng
• DNA i eukaryoter packas i kromatin m h a bl a histonproteiner för att få plats i kärnan
112
Centrala dogmat är gemensamt för allt liv ---> - Arbetskopia
Transkription (RNA-syntes) sker genom avläsning av DNA till flera RNA-kopior
113
RNA - uppbyggnad och struktur
Molekylen är uppbyggd som en kedja av sammankopplade nukleotider. Varje nukleotid består av en sockermolekyl, ribos, en fosfatgrupp och en kvävebas som kan vara av fyra olika slag. I RNA betecknas kvävebaserna med första bokstaven i namnen: A för adenin, U för uracil, G för guanin och C för cytosin.
-Sockret i RNA är ribos:
RNA är (oftast) enkeltrådigt
ribose (used in rebionucleic acid, RNA ), deoxyribose (used in deoxyribonucleic acid DNA ),
-RNA använder basen Uracil istället för Thymin:
uracil (used in RNA), themyne (used in DNA)
- Reglering av transkription påverkar mängderna av olika proteiner i celler
- Reglering av genuttryck styrs av proteiner som binder specifika DNA-sekvenser uppströms om gener
114
Centrala dogmat är gemensamt för allt liv ---> product
Proteinsyntes (translation) katalyseras av ribosomen...
Utanför cellkärnan finns cytoplasman och där översätts den genetiska informationen i mRNA:t till ett protein. Denna process kallas proteinsyntes eller translation. Översättningen sker med hjälp av två andra nukleinsyror, ribosomalt-RNA (rRNA) och transport-RNA (tRNA), och flera proteiner i den så kallade ribosomen.
...ett stort komplex bestående av både RNA och protein
- Proteinsyntes sker genom ihopsättning av aminosyror
115
Sammanfattning 2
| Uppbyggnad och struktur av RNA och proteiner
* RNA är oftast en enkelsträngad kedja bestående av ribonukleotider
* Sockret i RNA är ribos
* RNA använder basen Uracil istället för Thymin
* Reglering av transkription påverkar mängderna av olika proteiner i celler
* Reglering av genuttryck styrs av proteiner som binder specifika DNA-sekvenser uppströms om gener
* Proteinsyntes innebär ihopsättning av aminosyror och katalyseras av ribosomen
116
DNA replikation: Strukturen hos DNA
- Strukturen hos DNA: Dubbelspiral, antiparallell helix, baspar, major/minor groove
- DNA-syntesens kemi: Basparning, bildande av fosfodiesterbindningar
- DNA-replikation – originalsträngar agerar templat för varsin ny sträng
- Ny DNA-kedja byggs i 5’ till 3’ riktning
117
Start av DNA replikation
- Origin recognition complex (Orc ́s) – definierar replikationsstart.
- DNA helikaser gör DNA-templatet enkelsträngat.
- DNA helikaser är är ATP-beroende enzymer
118
RPA – det enkelsträngs (SS)-DNA bindande proteinet (SSB) stabiliserar enkelsträngat DNA
Förhindrar återförening av strängarna efter DNA-helikasets aktivitet
119
En RNA-primer krävs för att DNA- replikation ska kunna starta
Katalyseras av ett RNA-polymeras kallat DNA primas
120
Primaset ersätts med ett replikativt DNA polymeras
(BILD)
121
PCNA håller fast DNA-polymeras på DNA
- RFC (Clamp loader)
- PCNA (Clamp DNA)
- PCNA kallas även ”clamp”, ”sliding clamp” eller ”processivitetsfaktor”
- RF-C eller ”clamp loader” är ett ATPas som krävs för att ”ladda” PCNA på DNA
122
En schematisk replikationsgaffel
Helikas bryter ner vätebindningarna som håller de två DNA-strängarna ihop i spiralen. Den resulterande strukturen har två grenar bestående av en DNA-sträng vardera. Dessa två strängar tjänar som mall för de leading-strand och lagging-strand.
- Initiering av replikation skiljer sig åt mellan leading- och laggingstrand
- Både leading- och laggingstrand polymeraserna sitter ihop och rör sig i samma riktning – HUR?
123
Replikationsfilm
look at the video
124
Borttagande av RNA primrar
De steg som krävs
för att förena Okazaki-fragmenten till en lång DNA-kedja utan brott.
- Ligas klistrar igen hålen som är kvar (kräver ATP)
125
Den eukaryota replikationsgaffeln (BILD)
- Olika DNA polymeraser syntetiserar de båda strängarna. Pol epsilon (ɛ) syntetiserar leading strand – Pol delta (δ) syntetiserar lagging strand
- Den eukaryota replikationsgaffeln orsakar positiv supercoiling framför gaffeln – negativ supercoiling efter
- DNA topoisomeras 1 kan motverka positiv och negativ supercoiling
126
Topoisomeras-film
look
127
Telomeras-film
- Telomerer har speciella loop-strukturer för att skyddas
| - Replikation av kromosomändens lagging strand kräver Telomeras
128
Sammanfattning 3
Uppbyggnad och struktur av RNA och proteiner
* Strukturen hos DNA – Byggstenar, dubbelsträngshelix *DNA polymerasers funktion
* Enzymer och proteiner som deltar i replikation *Replikationsgaffeln – uppbyggnad och funktion *Topoisomerasers funktion
* Replikation av kromosomändar – Telomerasets funktion och struktur
129
DNA-reparation
- Korrekt basparning är nödvändig för korrekt nedärvning av arvsmassan
- DNA-replikation är semikonservativ
- En mutation som inte repareras nedärvs till hälften av alla dotterceller
- Gener är uppdelade i introner (icke-protein- kodande) och exoner (proteinkodande)
130
Det humana genomet innehåller flera olika typer av DNA-sekvenser
(BILD)
LINEs= Long Interspersed Nuclear Element
SINEs= Short Interspersed Nuclear Element
DNA-skador i proteinkodande regioner är mest allvarliga
131
Endast en korrekt basparad dNTP passar i active site
Den höga noggrannheten hos de replikativa DNA-polymerasen är i sig ett skydd mot att mutationer uppstår
132
DNA-polymeras kan korrekturläsa sin syntes
- polymeras (5 to 3)
| - editing (3 to 5)
133
DNA polymeras delta
- Exonuclease site
- Polymeras site
- De två katalytiska siten i de replikativa DNA-polymerasen är väl åtskilda
134
DNA-polymeras kan rätta sina misstag (exonukleasaktivitet)
Fel nukleotid har satts in av misstag
- DNA-polymeras 3’-5’ exonukleasaktivitet klipper bort fel-insatt nukleotid
- DNA-polymeras fortsätter koppla på nya nukleotider 5’-3’
135
Eukaryota celler har flera olika sorters DNA-polymeraser med olika funktioner
* DNA Pol α: DNA replikation
* DNA Pol δ: DNA replikation/DNA reparation : Proofreading aktivitet
* DNA Pol ε: DNA replikation/DNA reparation : Proofreading aktivitet
* DNA Pol γ: Mitokondriell DNA replikation
* DNA Pol ζ: Bypass syntes
* DNA Pol β: Base-excision reparation
* DNA Pol η: Bypass syntes
* DNA Pol θ: Bypass syntes/ Non-homologous end-joining?
* DNA Pol ι: Bypass syntes
* DNA Pol κ: Bypass syntes
* DNA Pol λ: Base-excision reparation
* DNA Pol μ: Non-homologous end-joining
Noggrannheten varierar mellan olika DNA polymeraser
136
Skador orsakade av insertion av ribonukleotider i DNA
En ribonukleotid inkorporeras felaktigt var 600-1000 baspar!!
137
Ribonucleotide excision repair (RER)
- ”Mismatch repair” reparerar replikationsfel
- Men hur kan reparationskomplexet veta vilken sträng som är nygjord och därför innehåller fel nukleotid?
- Mismatch repair-systemet korrigerar fel gjorda av Pol δ och Pol ε vid replikation,som inte
reparerats av proof-readingfunktionen
- Nicks i nysyntetiserad lagging DNA-sträng styr vilken av strängarna som repareras av MM-systemet i eukaryoter
- Ökad mutationsfrekvens kan medföra cancer, Saknar man korrekturläsning hos Pol δ eller Pol ε, eller ett fungerande mismatch repair system drabbas man av tjocktarmscancer.
138
Kan DNA muteras när det inte kopieras?
| Spontana DNA-förändringar
• Depurinering–purin-baserna(AellerG)lossnarpga. reaktion med vatten (hydrolys).
18 000 depurineringar i en cell/dygn
- Exempel depurinering av DNA
• Depurinering–purinbaserna(AellerG)lossnarpga. reaktion med vatten (hydrolys).
18 000 depurineringar i en cell/dygn
• DeamineringavCtillU–NH2hydrolyseras. 100 deamineringar av C/dygn
139
Vad händer om deaminering inte lagas?
- Deaminerade DNA-baser är lätta att identifiera
| bild
140
Hur undviker vi mutationer pga. spontana bas-förändringar?
* Bas-förändringarlagasmed”Baseexcisionrepair”
| * FinnsenmängdolikaDNA-glykosylassomspecifikt känner igen olika bas-förändringar t.ex. Uracil-DNA- glykosylas
141
Base excision repair
- DNA-glykosylas hydrolyserar bort felaktig bas
- AP-endonukleas klipper bort ryggrad
- DNA-polymeras Ligas
142
Hur bildas DNA-mutationer när DNAt inte kopieras?
* Spontanabas-förändringar
| * Induceradebas-förändringar
143
Inducerade DNA-förändringar
* Pyrimidin-dimerer–orsakasavUV-strålning
| * ”Bulkylesions”avpolycykliskaaromatiskakolväten - finns i tobaksrök, tjära, brandrök
144
Inducerade DNA-förändringar
* Pyrimidin-dimerer–orsakasavUV-strålning
* ”Bulkylesions”avpolycykliskaaromatiskakolväten - finns i tobaksrök, tjära, brandrök
UV-inducerad pyrimidin-dimer i DNA
145
Pyrimidindimerer repareras av Nucleotide Excision Repair (NER)
(bild)
-Multienzymkomplex scannar DNA och hittar deformation
-Nukleaser klipper en bit innan och efter skada
Helikas separerar dubbelsträngarna så klippt sträng lossnar
-DNA-polymeras fyller igen med nya deoxynukleotider Ligas lagar hålet
146
Defekter i ”NER” medför sjukdom
- Multienzymkomplex scannar DNA och hittar deformation
- Nukleaser klipper en bit innan och efter skada
Helikas separerar dubbelsträngarna så klippt sträng lossnar
(CROSS OVER THEM)
- Ex . Xeroderma pigmentosum
147
Transkriptionskopplad NER
(BILD)
- NERBulky lesion eller Pyrimidindimer
- RNA-polymeras stannar vid skada
- NER proteiner snabbt på plat
-Resten av NER-komplex aktiveras Skadan lagas
Transkriptionen fortsätter
148
Defekt i transkriptionskopplad NER medför sjukdom
Ex . Cockaynes syndrom
149
Defekt NER (nuclear excicsion repair) orsak till cancer
• Xerodermapigmentosum:Ärftligsjukdomdär drabbade individer är extremt känsliga för UV- strålning. Defekt NER kan inte reparera pyrimidin- dimerer vilket orsakar hudskador och ökad risk för hudcancer
150
Transkriptionskopplad NER
* ViharväldigtmktDNAsommåsteskannasavNER
* FörattjustkodandeDNAskalagaseffektivt-så transkriptionen av generna inte stoppas - kopplas NER till RNA-polymeras
* DefekttranskriptionskoppladNERorsakar Cockaynes syndrom (ärftligt fortskridande multiorgansyndrom som bla. medför utvecklingsstörning, ”för tidigt åldrande”-utseende, förkortad livslängd)
151
Problem: oreparerad ”bulky” skada under replikationen
* OmDNA-skadaintelagatskanDNA-polymeras fastna vid skadad nukleotid och replikationen stannar
* Lösning:Speciellatranslesionpolymerasertaröver replikationen en bit och tar sig förbi skadan
* Vanliga DNA-polymeraser fortsätter replikationen igen när skadan passerats
152
Translesion polymeras - syntetiserar förbi DNA-skador
(BILD)
153
Inducerade DNA-förändringar
* Pyrimidin-dimerer–orsakasavUV-strålning
* ”Bulkylesions”avpolycykliskaaromatiskakolväten - orsakas av tobaksrök, tjära, brandrök
* Dubbeltrådsbrott–Orsakasavjoniserandestrålning, replikationsfel, oxiderande ämnen
154
Dubbeltrådsbrott är allvarligt har två möjliga reparationsvägar
* Non-homologousend-joining:quickanddirty
| * Homologrekombinering:ffaunderreplikationen(och vid meios)
155
Non-homologous end-joining
- Dubbeltrådsbrott upptäcks av Ku
- DNA-ändarna putsas till av nukleaser
- Ändarna klistras ihop av ligas
- Nackdel: Viss DNA-sekvens går förlorad
156
DNA-reparation via homolog rekombinering orsakad av ”nicks” i DNA leder till brutna replikationsgafflar
(bild)
157
DNA-reparation via homolog rekombinering orsakad av brutna replikationsgafflar
(bild)
158
Homolog rekombinering – felfri reparation
- Homolog rekombination är en typ av genetisk rekombination där information mellan två homologa DNA-molekyler utbyts. Att DNA-molekylerna är homologa innebär att de är olika versioner av "samma" DNA-sekvens, till exempel samma gen på olika kromosomer i ett kromosompar.
(bild)
159
Defekt homolog rekombinering orsak till cancer
* Braca1 och Braca2 är involverade i homolog rekombinering
| * MutationeriBraca1ellerBraca2genernaärvälkända orsaker till ärftlig bröst- och äggstockscancer
160
Homolog rekombinering kan leda till ”cross-overs” eller ”gene conversions”
(bilder)
161
Sammanfattning reparationsvägar
(bild)
162
Vid DNA-skada aktiveras cellcykelarrest och DNA-reparation
* ATMärettDNA-skadesignalerandekinassom fosforylerar målproteiner vid DNA-skada
* DefektATMorsakarsjukdomenAtaxiatelangiectasia (AT) med neurodegeneration, ökad cancerrisk, och genom-instabilitet som följd
163
Konsekvens av utebliven reparation – olika typer av DNA-mutationer
-- Punktmutation eller genmutation är en mutation som inträffar när en kvävebas byts ut mot en annan eller när två intilliggande kvävebaser byter plats.
Punktmutation: – substitution = Byts ut bas (kan va allvarlig)
Punktmutation: insertion = Sätter in Bas
Punktmutation: deletion = Plockar bort bas
164
Repetitiv sekvens är svår-replikerad
Repetitiv sekvens är svår-replikerad
165
• Translokation: ex. via transposoner
| -DNA-transposoner
DNA-bit klipps ut och klistras in på ny plats av enzymet transposase
166
”Via RNA”-transposoner
1. DNA läses av (transkriberas) till RNA
2. RNA omvänt-transkriberas till DNA
3. DNA sätts in på ny plats
4. Transposonen finns nu på en plats till
5. Om i kodande sekvens får det konsekvenser ex. hemofili
167
Transposoner utgör mer än 40% av vårt genom!
(bild)
168
Fortsättning olika DNA-mutationer
```
• Punktmutation: – substitution
– insertion
– deletion
• Translokation ex. LINES
• Större kromosomförändring
```
169
Kromosomförändringar p g a dubbeltrådsbrottsreparation
- Två olika kromosomer drabbas av dubbeltrådsbrott
- De två olika kromosomern repareras korrekt, oberoende av varandra
- De två olika kromosomernas ändar sätts felaktigt ihop med varandra. Kan ske på två olika sätt
- De två olika kromosomerna repareras på olika sätt så ena kromosomens information dubbleras, medan den andra försvinner
170
Genreglering och kromatin:
| 1.Transkriptionell reglering i prokaryoter
Ett klassiskt exempel som fungerar som typexempel på transkriptionell reglering i prokaryoter är lac operonet
- När E.coli växer i glukos är uttrycket av b-galaktosidasenzymet mindre än 10 molekyler/cell. I närvaro av laktos OCH frånvaro av glukos induceras enzymet 1000-falt
- Även två andra enzymer som deltar i metabolismen av laktos induceras på samma sätt. Viktiga är lactose galactose och glucose.
171
Lac operonet
- Lac-operonet i E. coli är ett exempel på ett operon, som regleras både positivt och negativt. På grundläggande nivå, tas lac-operonet ofta upp som ett exempel på reglering av transkription. Tyvärr tar man då bara upp den negativa regleringen, vilket, som vi skall se, bara är halva sanningen.
I lac-operonet (ovan) ingår tre gener som hjälper bakterien att leva på laktos (mjölksocker) som enda kol- och energikälla (se nedan):
Genen för β-galaktosidas, som spjälkar laktos (LacZ).
Genen för galaktosid-permeas (LacY). Detta protein bildar en por i cellmembranet, och släpper in laktosmolekylen genom den poren.
Genen för tiogalaktosid-transacetylas (LacA). Detta proteinets fysiologiska funktion är okänd.
Promotorn (P) och operatorn (O) ingår också i operonet, liksom aktivatorns bindningsställe (C). Slutligen ingår också en repressorgen (I) och dess promotor (PI) i operonet.
(BILD)
P= promotor
i= gen kodande för repressor av laktosoperonet
o= Lac operator
z,y,a= gener som kodar för enzymer involverade i laktosmetabolism
Z= β-galaktosidasenzymet Y= Laktospermeas
172
Lac repressorn/operatorn/ Lac aktivatorn
-Symmetrisk, palindromsekvens. (Världens längsta palindrom:
”saippuakivikauppias”
-lac repressorn binder med hög affinitet till lac operatorn i frånvaro av laktos.
-Bindningen av repressorn till operatorn förhindrar RNA polymeraset från att binda till promotorn
-Palindromsekvensen finns endast på detta ställe i hela E.coli genomet.
-Repressorn binder till sidoprodukter (inducers) som bildas vid β-galaktosidasreaktionen av de få molekyler som finns innan induktion.
-När repressorn binder inducer sänks dess affinitet för operatorn kraftigt.
-Lac aktivatorn
CAP (=catabolite activator protein) binder specifikt till DNA-
sekvenser (palindrom) i vissa promotorer t ex Lac promotorn.
Aktiveras när cAMP-nivåerna är höga. T ex vid låg glukoskoncentration.
173
Transkriptionell aktivering
- CAP (=catabolite activator protein) binder specifikt till DNA- sekvenser (palindrom) i vissa promotorer t ex Lac promotorn.
- Aktiveras när cAMP-nivåerna är höga. T ex vid låg glukoskoncentration.
- Alltså: För att Lac promotorn ska vara aktiv måste laktosnivåerna vara höga och glukosnivåerna låga (=cAMP hög)
- CAP innehåller ytor som interagerar med RNA polymeras. -RNA pol rekryteras till promotorer som bundit CAP.
174
2. Kromatin och dess betydelse för reglering av genexpression i eukaryoter
Kromatin är komplex av DNA och proteiner, huvudsakligen histoner men även andra genregulatoriska proteiner, i eukaryota celler. Kromatinets struktur bestäms av hur upplindad DNA-spiralen är runt kromatinets histoner.
Organisation av DNA i kromosomer:
- Jäst, bananfluga och humana celler innehåller 4, 40 resp. 1000 ggr mer DNA än E.Coli
- Eukaryota celler lagrar sitt DNA i kärnan. Prokaryoter saknar kärna
- Humana celler har c:a 3 miljoner baspar = 2 m lång tråd. Kärnans diameter är ca 6 μm→ stort packningsbehov.
175
Histoner
- Små, basiska proteiner (Arg, Lys). DNA i sig är negativt laddat p g a många fosfat grupper.
- [DNA]:[histoner]= 1:1
- 4 histonproteiner: H2a, H2b, H3, H4
- C:a 140 bp DNA ligger virat (2 varv) runt en histonoktamer (2 st var av varje histon). Denna struktur kallas en nukleosom
- Nukleosomstrukturen medför c:a 7 ggr packning av DNA. Har även betydelse för reglering av genuttryck (se senare)
- DNA som packats m h a proteiner (histoner) kallas kromatin
176
Histon H1
1 histon H1 binder på utsidan av varje nukleosom. Håller samman strukturen
Leder till bildande av ”30 nm fiber” Resultat: 40 ggr packning av DNA
C:a 1000 ggr packning krävs för att humant DNA ska få plats i kärnan.
Vidare packning sker via H1:H1 interaktioner samt mindre utforskade mekanismer
177
Kromosomer
En kromosom är en obruten, dubbeltrådig DNA sträng
Innehåller både heterokromatin (mycket kondenserat, transkriptionellt inaktivt DNA) samt eukromatin (mindre kondenserat, mer transkriberat)
178
Kromatin har en generellt negativ effekt på transkription
Områden i DNA med hög transkriptionell aktivitet är mindre packat än områden av DNA med låg transkriptionell aktivitet.
Nukleosomer kan förhindra bindning av både reglerande proteiner och generella transkriptionsfaktorer till DNA genom att blockera deras igenkänningspositioner.
179
Kromatinremodellering I Kovalent modifiering av histonsvansar
- Kovalent modifiering av histonsvansar och vissa DNA- sekvenser – effekt på transkription
De N-terminala delarna av histon- proteinerna ”sticker ut” från nukleosomen och deltar ej i DNA-interaktion
Svansarna innehåller många lysiner som kan modifieras på olika sätt (acetylering, fosforylering, metylering mm
Modifieringarna av svansarna påverkar hur kondenserat DNA:t är.
T ex acetylering av svansar leder till flera neg. laddningar → nukleosomer repellerar från varandra → mindre kondensering
180
Kromatinremodellering II
ATP-beroende förflyttning eller borttagande av nukleosomer
181
Enhancers
Är DNA sekvenser som kan ligga 1000-tals baspar från en gen me ändå påverkar transkriptionen av genen.
Enhancers kan ligga uppströms, nedströms eller mitt i den gen de reglerar.
Enhancers fungerar ofta genom att rekrytera proteinkomplex som modifierar kromatinmönstret runt enhancern
182
3. Transkriptionell reglering i eukaryoter
Är mycket mer komplex än hos prokaryoter p g a många fler generella transkriptionsfaktorer
Liknar prokaryot reglering genom att verka via reglerande proteiner som binder till specifika sekvenser i promotorer.
Reglerande proteiner kontaktar de generella transkriptionsfaktorerna indirekt och påverkar deras funktion. Repressorer hämmar – aktivatorer stimulerar.
183
Transkriptionella aktivatorproteiner består av olika specialiserade domäner
1. DNA-bindande domän – interagerar sekvensspecifikt med DNA
2. Aktiveringsdomän – interagerar direkt eller indirekt med generella transkriptionsfaktorer
(3. Ligandbindningsdomäner – specifika för hormonreceptorer)
(4. Dimeriseringsdomäner – vissa aktivatorer t ex hormonreceptorer)
184
DNA-bindande domäner kan grupperas efter sin struktur
(BILD) Helix-turn-helix, Leucine zipper, Leucine zipper
- Alla transkriptionsfaktorer innehåller dock DNA-bindande regioner vilket särskiljer dem från andra proteiner som är involverade i genuttryck såsom t.ex. kromatinremodelerare och metylaser som ej har DNA-bindande regioner
Är en struktur som ofta finns i prokaryota proteiner som binder DNA som dimerer till palindromsekvenser. T ex CAP-proteinet.
- Leucine zipper
- Zink-finger
185
Transkriptionella reglerproteiner binder till promotorområdet
(BILD)
- ...t ex som svar på olika signaler via signaltransduktionsproteiner
- ....men hur överförs signalerna till det generella transkriptionsmaskineriet?
186
Transkription av en gen kan återskapas i provrör med rena GTF
...men dessa faktorer är inte tillräckliga för att svara på signaler från reglerande proteiner
187
Mediator
| -komplexet
```
(BILD)
-Är nödvändig för reglerad transkription
Har positiv effekt på basal transkription och stimulerar TFIIH- fosforylering av CTD.
25-30 subenheter beroende på species
Binder till CTD på den största RNA
```
-Uttrycksnivån från en viss promotor är resultatet av samverkan mellan flera transkriptionella reglerproteiner
188
Modell för transkriptionell reglering via Mediatorkomplexet
```
(BILD)
-
-Reglerande proteiner (aktivatorer/repressorer) binder till promotor.
-Mediatorkomplexet binder till de reglerande proteinerna.
-RNA pol II rekryteras.
-GTFs rekryteras / PIC byggs upp.
-Signalöverföring via Mediatorkomplexet.
-Fosforylering av CTD.
-Elongering startas.
```
189
Icke-kodande RNA och reglering av genexpression
Olika typer:
1. Mikro RNA (miRNA):
Korta (22 nukleotider) dubbeltrådiga RNA som produceras av cellen själv
2. Small-interfering RNA (siRNA)
Bildas från längre RNA med hairpinstruktur
Processas m h a Dicer (endonukleas), RISC (ATP-beroende bortklyvning av antisense-sträng)
Bildas som dubbeltrådig RNA av exogena källor (virus, experimentellt)
Processas på samma sätt som miRNA
3. Long non-coding RNA (lncRNA)Längre (>200 nt) RNA som kan reglera genuttryck på flera sätt t ex genom att interagera med proteiner involverade i transkription, splicing, translation, epigenetisk kontroll
+ BILD
190
Molekylärbiologiska metoder
DNA ---> mRNA ---> protein
* Polymerase chain reaction (PCR) ex. faderskapstest
* Elektrofores ex. brottsplatsutredning
* Sekvensering av DNA
* Hybridisering ex. microarray
* Rekombinant uttryck av protein
191
Polymerase Chain Reaction (PCR)
(BILD)
- Polymeraskedjereaktion, engelska Polymerase Chain Reaction, är en molekylärbiologisk och biokemisk metod som används för att amplifiera ett exemplar eller ett fåtal kopior av en viss DNA-sekvens över flera storleksordningar, vilket genererar tusentals, och upp till miljontals exemplar av en enskild DNA-sekvens.
192
Gel-elektrofores
Gelelektrofores är en metod för att separera molekyler genom användande av fenomenet att de rör sig med olika hastighet i en gel och under inverkan av ett elektriskt fält.
193
Variation i Short tandem repeats (STR) medför unik DNA profil
(BILD)
Mikrosatelliter är DNA-segment som består av sekvenser av 1-6 baspar som repeteras i en lång följd. Mutationshastigheten i segmenten är hög. En typisk mutation resulterar i att en repetition tas bort eller läggs till, och längden på sekvensen varierar därför kraftigt mellan individer.
194
Brottsplats- utredning
(BILD)
195
Dideoxy-DNA-sekvensering
DNA-sekvensering är den process som används för att med biokemiska metoder bestämma ordningen av kvävebaserna adenin, guanin, cytosin och tymin i DNA.
196
DNA-syntes
(BILD)
- Replikation eller replikering är den process som dubblerar DNA-molekylen vid celldelningen så att en kopia av molekylen kan hamna i varje dottercell. På så sätt förs den genetiska informationen vidare från cellgeneration till cellgeneration. Replikationen är en omfångsrik och komplex process.
197
DNA-sekvensering
(BILD)
-DNA-sekvensering är den process som används för att med biokemiska metoder bestämma ordningen av kvävebaserna adenin, guanin, cytosin och tymin i DNA.
198
Hybridisering med probe - hitta specifik DNA bit i DNA-blandning
(BILD)
- En hybridiseringssond, sökfragment, sond, prob, eller ibland gensond är en molekyl som används för att spåra andra, intressanta molekyler. Inom molekylärbiologin består sökfragmentent oftast av nukleinsyra av en viss sekvens, som binder till en sekvens man vill hitta.
199
Microarray
(BILD)
- Mikromatriser, genchips, DNA-chips eller microarrays är en molekylärbiologisk metod för att samtidigt mäta de relativa koncentrationerna mRNA för tusentals olika gener i ett prov, exempelvis odlade celler eller en vävnad.
200
Klippa och klistra i DNA
(BILD)
-??????
201
DNA-kloning
(BILD)
- Kloning innebär att man skapar en identisk kopia av något.
Genom att ta sticklingar från en viss växt så klonas just den växten, till exempel så har man klonat en pelargon när man tar sticklingar från den. Bakterie- och jästceller som delar sig är varandras kloner. Inom gentekniken kan man klona en viss gen genom att isolera just den biten och sedan föröka upp den.
Kloning används också för att beskriva hur DNA-fragment sätts in i en annan DNA-molekyl, en så kallad vektor. Detta görs med hjälp av rekombinant-DNA-teknik. Vektorn, med det nya DNA-fragmentet, förs in i en cell där den kan replikeras, det vill säga kopieras upp i en större mängd.
202
Rekombinant-DNA-uttryck
(BILD)
- Den plasmid som nu bildas består av rekombinant DNA. Det kallas rekombinant DNA, eftersom det består av DNA från två olika organismer, som kombinerats ihop.
203
Rekombinant proteinuttryck
(BILD)
?????
- Vid produktion av rekombinanta proteiner sätter man in genen, som kodar för proteinet man vill framställa, i en värdorganism (till exempel en bakterie). Värdorganismen är den organism som sedan producerar det rekombinanta proteinet.
204
RNA syntes - Transkription
Centrala dogmat:
- I kärnan
- I kärnan
- I cytoplasman
205
Organisation av gener i kromosomer
(BILD)
-En gen består av en viss sekvens nukleotider som genom den genetiska koden beskriver en sekvens av aminosyror, vilka i sin tur bygger upp ett protein. Informationen i DNA-molekylen översätts, transkriberas, till olika former av RNA som styr tillverkningen, syntesen, av proteinet i cellens ribosomer.
206
Transkription
- Transkription, eller RNA-syntes, är den process varmed genetisk information i cellens DNA översätts till information i RNA. Vid transkriptionen byggs mRNA upp med DNA som mall. Det enzym som står för översättningen från DNA till mRNA heter RNA-polymeras II.
Transkription kräver:
- Att DNA-templatet smälts
- Närvaro av ett enzym som kan kopiera den ena av DNA-strängarna - Närvaroavdefyraolikaribonukleotiderna.
207
Ribonukleotider
- Byggstenar för RNA syntes
- Kemiska uppbyggnaden viktig för förståelse av funktion -Socker + fosforsyra + bas (purin eller pyrimidin) -Sockerdelen i RNA är en ribos (OBS! Numrering av C)
208
Baserna i RNA
(BILD)
209
RNA struktur
Ryggraden i RNA består av riboser förenade via fosfodiesterbindningar
En RNA-sträng har polaritet och skrivs samt syntetiseras i 5 ́ till 3 ́ riktning:
AGC≠CGA
210
Olika typer av RNA
många (BILD)
- mRNA. messenger-RNA (budbärar-RNA), överför information från DNA i cellkärnan till ribosomerna i ER
- tRNA. transfer-RNA (överförar-RNA), överför aminosyror som sedan sätts ihop till polypeptider – proteiner.
- rRNA. ribosomalt RNA, ingår som en viktig beståndsdel i ribosomer.
- ......
211
Proteinkodande gener
- Genuttryck är den process på flera olika steg genom vilken informationen i en gens DNA-sekvens överförs till cellens strukturer och funktioner. Genuttryck har i allmänhet proteiner som slutprodukt, men det finns även icke-kodande gener vars slutprodukter är själva RNA-molekylen (rRNA, tRNA).
- DNA lagrar genetisk information och är templat (mall) för transkription.
En gen= DNA-sekvens kodande för uttrycket (och regleringen av uttrycket) för ett protein
Det humana genomet innehåller c:a 25.000 gener, men kodar för många fler proteiner (se splicing senare)
212
RNA polymeraser
RNA-polymeras är ett enzym som är direkt involverat i transkriptionen, det vill säga den process då cellens DNA omskrivs till budbärar-RNA. När en specifik gen ska transkriberas görs genens promotor tillgänglig så att RNA-polymeraset kan binda in.
Skiljer sig på flera sätt mellan prokaryoter och eukaryoter, men har samma grundläggande funktioner:
1. Känner igen och binder till promotorer (område där transkription startar)
- 1. Prokaryota: (Bild)
- 2. Eukaryota: (Bild)
2. Smälter DNA kring transkriptionsstarten. Bildar enkeltrådigt templat.: (BILD)
3. Använder templatet som mall för att välja rätt ribonukleotid som sätts in i RNA kedjan genom katalys av fosfodiester- bindningar. OBS!! Kräver ingen primer (Jmf DNA pol): (BILD)
4. Är processiva – det RNA-polymeras som startar transkriptionen avslutar den också. Släpper aldrig templatet. Hastighet ~20 nt/sek
5.Känner igen termineringssignaler
Sker ofta efter sekvens som kan bilda GC-rik ”stem-loop struktur” följd av AU-rik sekvens.
Hairpin orsakar transkriptionell pausning – AU-sekvens orsakar dissociering av RNA-DNA hybrid.
En annan typ av terminering styrs av rho proteinet som ”jagar” RNA polymeraset. När polymeraset når en stem-loop kommer rho ikapp polymeraset och gör att det dissocierar
6. Kommunicerar med reglerande proteiner som binder till promotorområdet
213
Basala transkriptionsmekanismer
-1. De faktorer och mekanismer som är nödvändiga för
att avläsa (=transkribera) en gen till ett mRNA utan att gå in på hur processen regleras.
-2. Processningen av mRNAt.
-3. Elongering.
-4. Termineringen.
214
Prokaryot RNA polymeras
- Fyra subenheter (α2ββ ́) – core
- Sigmafaktor krävs för igenkänning av promotorn
– släpper innan start.
- Smälter c:a 17 bp – ”transkriptions- bubbla”
- Bubblan förflyttar sig utefter templatet under transkriptionen.
- En DNA-RNA hybrid på c:a 8 bp är konstant under elongeringen
215
Sigma faktorer
Ökar RNA polymerasets promotor-igenkänningsförmåga på två sätt:
- Minskar polymerasets bindningsförmåga till DNA 104 ggr - Ger polymeraset förmåga att binda till specifika
promotorsekvenser
Flera sigmafaktorer finns för interaktion med olika typer av promotorer. σ70 är vanligast och känner igen sekvensen TATAAT
216
Transkriptionscykeln för prokaryoter
(BILD)
217
Vissa antibiotika är transkriptions-inhibitorer
Rifampicin blockerar den del av det prokaryota polymeraset där DNA-RNA hybriden måste passera.
218
Eukaryot transkription
Skillnader mot prokaryot:
- Utförs av tre olika RNA polymeraser (pol I, II, III) i eukaryoter, men ett RNA polymeras i prokaryoter.
- Transkription och translation är skiljd i tid och rum i eukaryoter. Transkription sker i kärnan – translation i cytoplasman
- Eukaryota RNA polymeraser kräver flera transkriptions- proteiner (faktorer) för att kunna initiera transkription.
- Eukaryoter processar och modifierar det primära RNA:t - Templatet i eukaryoter är packat i kromatin.
219
Eukaryota RNA polymeraser
RNA polymerase I – Syntetiserar stora ribosomala (r)RNA (5.8S, 18S, 28S)
RNA polymerase II – Syntetiserar alla protein-kodande messenger mRNA samt
small nucleolarar (sno)RNA, microRNA, siRNA, lncRNA och snRNA.
RNA polymerase III – Syntetiserar transfer (t)RNA och 5S rRNA samt vissa small nuclear (sn)RNA.
De tre RNA polymeraserna har inga överlappande funktioner, men delar vissa subenheter. Alla tre RNA polymeraser använder det TATA-bindande proteinet (TBP) för initiering av transkription
Skiljer sig från E.Coli RNA polymeraset genom:
- Mer komplexa strukturer
- Saknar egen promotor igenkänningsförmåga.
220
RNA polymerase II
(Bild)
12 st. proteinsubenheter.
C-terminal domän (CTD) på största subenheten:
- Heptapeptid (YSPTSPS) repeterad 26 ggr i jäst, 52 ggr i humana celler
- 11 kopior av heptapeptiden krävs för viabilitet - Heptapeptiden är fosforylerad på flera
positioner. Ser-2 och Ser-5 fosforylering är
vanligast.
- Icke-fosforylerad form av RNA polII binder
promotor
- Elongerande form är fosforylerad på flera
positioner i CTD
3D-struktur bestämd till c:a 2Å
221
Basal (oreglerad) transkription
Kräver deltagande av generella transkriptionsfaktorer (GTF):
- Hjälper till att positionera RNA polymeras II på promotorn.
- Är nödvändiga för att smälta templatet.
- Är viktiga för att frisätta RNA pol II från promotorn vid övergång till elongeringsfas. - Kallas ”generella” eftersom de är nödvändiga för transkription av alla gener.
222
TBP - TATA bindande proteinet
Består av en proteinsubenhet
Startar uppbyggnaden av ett pre-initieringskomplex (PIC).
Binder till minor groove i TATA-boxen →kraftig, lokal DNA distorsion som troligen fungerar som igenkänning av aktiva promotorer
Bildar TFIID komplex med TAFs (TBP-associerade faktorer)
Strukturen av TBP bunden till TATA är bestämd på atomär nivå m h a röntgenkristallografi
223
TAFIIs ??
12 proteinsubenheter som bundet till TBP utgör TFIID (TBP+TAFs=TFIID).
Funktionen för TFIID är troligen att förstärka bindningen mellan TBP och TATA-boxen genom att binda till kringliggande DNA sekvenser.
Alla gener som kodar för TAFII proteiner är essentiella för viabilitet.
224
Alternativa sekvenser som bestämmer lokalisation för transkriptionsstart
-Endast ~25% av alla proteinkodande gener har TATA-box
-Initiator (INR): C/T C/T A N T/A C/T C/T, binder TFIID och överlappar med transkriptionsstarten
-Downstream promoter element (DPE) : A/G G A/T C G T G,
binder TFIID och är placerad ca 30 baspar 3 ́ om transkriptionsstarten
-TFIIB recognition element (BRE) G/C G/C G/A C G C C, binder TFIIB och är placerad just 5 ́om TATA-boxen
225
TFIIA
● Består av tre proteiner
● Oklart om TFIIA är en GTF. Behövs ej i rena in vitro transkriptionssystem. ● Har anti-repressor aktivitet.
● Underlättar TBP-TATA interaktion
226
TFIIB
● En proteinsubenhet
● Bildar ett komplex med TBP eller TBP+TFIIA bundet till DNA. ● Kan binda DNA på båda sidorna om TATA-boxen.
● Preciserar positionen för transkriptionsstart .
● Binder till RNA polymerase II.
227
TFIIF
● Består av två proteinsubenheter
● Har både strukturella och funktionella likheter med bakteriella sigmafaktorer→motverkar ospecifik bindning av RNA polymeras II till DNA
● Interagerar med RNA polymeras II även när de båda inte är bundna till DNA-templat
● Är den enda GTF som fortsätter att vara bunden till RNA polymeras II under elongering.
228
TFIIE
● Två proteinsubenheter
● Binder direkt till RNA polymerase II
● Påverkar CTD-kinas aktiviteten hos TFIIH (se nästa bild)
● Binder direkt till TFIIH i PIC
● Lilla subenheten binder just uppströms (5 ́) om startpositionen i PIC ● Viktig för stabilisering av enkeltrådigt DNA nära transkriptionsstarten.
229
TFIIH
●Mest komplex av alla GTF - 9 st proteinsubenheter.
● Binder direkt till med TFIIE.
● Katalyserar fosforylering av den C-terminala domänen på RNA polymerasets största protein- subenhet.
● Innehåller två DNA-beroende ATPaser/helikaser som krävs för DNA smältning av c:a 10 bp
runt transkriptionsstarten.
● Alla TFIIH-proteinsubenheter har även identifierats
som proteiner involverade i NER (=Nucleotide excision DNA repair).
● TFIIH finns i två former:
1. Transkriptions-form: 6 subenhets-core + TFIIK (CTD-kinas) 2. NER form: 6 subenhets-core + andra NER proteiner.
230
TFIIH och sjukdomar
Mutationer i humana TFIIH gener hittas hos patienter med Xeroderma Pigmentosum (XP), Cockayne ́s syndrome (CS) och trichothiodystrofi (TTD).
Aktivt transkriberade gener repareras snabbare än andra gener (Transkription- coupled DNA repair)
231
GTF interaktioner
Surface plasmon resonancestudier (BiaCore) har visat att de generella transkriptions- faktorerna använder ett minimalt antal interaktioner för bildande av PIC: (BILD)
232
Uppbyggnad av PIC - transkriptionsinitiering
(BILD)?????
233
Transkriptionsinitiering kan delas in i steg
1. Formering av preinitieringskomplex (PIC).
2. PIC aktivering – ”smältning” av DNA kring transkriptionsstarten.
3. Initiering – bildandet av den första fosfodiester
bindningen
4. Promoter clearance – CTD fosforyleras, RNA polymeraset lämnar promotorn, PIC bryts upp.
5. Elongering - RNA polymeras + TFIIF bildar ett elongeringskomplex med andra elongeringsfaktorer
6. Terminering – Mekanismerna är inte utredda för eukaryoter. RNA polymerasets CTD defosforyleras i samband med terminering
(BILD)
234
Mediator
```
Är nödvändig för reglerad transkription
Har positiv effekt på basal transkription och stimulerar TFIIH- fosforylering av CTD.
25-30 subenheter beroende på species
Binder till CTD på den största RNA
polymeras II subenheten
```
235
Transkriptionella reglerproteiner binder till promotorområdet
....men hur överförs signalerna till det generella transkriptionsmaskineriet?
(BILD) ???
236
Specifika subenheter på ytan och
konserverade subenheter mot det generella
transkriptionsmaskineriet ?
- Regulatoriska proteiner
- Mediatorn
- RNA pol II
237
Modell för transkriptionell reglering via Mediatorkomplexet
Reglerande proteiner (aktivatorer/repressorer) binder till promotor. Mediatorkomplexet binder till de reglerande proteinerna.
RNA pol II rekryteras. mRNA GTFs rekryteras / PIC byggs upp.
Signalöverföring via Mediatorkomplexet.
Fosforylering av CTD.
Elongering startas.
238
Icke-kodande RNA och reglering av
| genexpression
Olika typer:
1. Mikro RNA (miRNA): Korta (22 nukleotider) dubbeltrådiga
RNA som produceras av cellen själv
Bildas från längre RNA med hairpinstruktur
Processas m h a Dicer (endonukleas), RISC (ATP-beroende bortklyvning av antisense-sträng)
2. Small-interfering RNA ((siRNA)): Bildas som dubbeltrådig RNA av exogena källor (virus, experimentellt)
Processas på samma sätt som miRNA
3. Long non-coding RNA: Längre (>200 nt) RNA som kan reglera genuttryck på flera sätt (lncRNA) t ex genom att interagera med proteiner involverade i transkription, splicing, translation, epigenetisk kontroll
239
Icke-kodande RNA och mekanismer för reglering av genexpression
(BILD)
240
Transkriptionselongering
- Flera faktorer som är viktiga för transkriptionell elongering har identifierats:TFIIS, elongator, FACT, elongin, TFIIF.
- Vissa faktorer har specifik betydelse för genomläsning av sekvenser med speciell struktur eller genom nukleosomalt DNA- templat.
- Transkription inducerar supercoiling av DNA-templatet före och efter RNA polymeraset. Supercoiling kan utgöra ett hinder för elongering.
241
Post-transkriptionella modifieringar (borde kanske kallas ko-transkriptionella modifieringar)
1. Capping
2. Splicing
3. Polyadenylering
Är viktiga för att markera att båda ändarna av mRNA:t är intakta innan mRNA:t transporteras ut från kärnan till cytoplasman
Fosforylering av CTD vid övergång från initiering till elongering är även viktig för att binda RNA polymeras II till faktorer som katalyserar post- transkriptionella modifieringar
242
5 ́-capping
eller 5'-kåpor, är en form av nukleotid som appliceras under pre-mRNAprocessingen av nysyntetiserat, omoget mRNA. ... Reaktionen då mRNA-kedjan förses med en 5'-cap utförs av ett enzymkomplex kallat Capping Enzyme Complex (CEC), som enbart finns i cellkärnan.
-Capping sker ko- transkriptionellt så snart c:a 25 nt mRNA har syntetiserats.
-Capping är viktig för initiering av translation hos
eukaryoter.
-Cap-strukturen består av
en metylerad guanin som adderas till 5 ́-ända samt eventuell ytterligare metylering av
de första två positionerna
i RNA:t
243
Splicing
De proteinkodande delarna av en gen (exoner) i DNA är avbruten av icke-kodande sekvenser (introner).
244
Definition av splicingpositioner
- RNA-splitsning är en posttranskriptionell förändring av mRNA som nyligen syntetiserats. Hos eukaryota celler består varje gen av en till hundratals exoner. Dessa bitar av funktionell DNA-kod kan sättas ihop i olika transkript, och skiljs åt av så kallad intronsekvenser, som inte används för att koda för proteiner.
- If the substrate requires a splice to pass, the positioner is the equipment that jumps the splice with a micro movement. ... The splice jump movement is enough to allow the splice to pass without keeping the slot die disengaged too long. Repeatability is typically 0.0001 inch (2.54 microns).
-Splicing måste vara exakt – 1 bp fel ger frameshift.
Positionerna för splicing bestäms av sekvenser i intronernas ändar.
245
Splicing – två transesterfieringar
Utklyvning av intronsekvenser via bildande av lassostruktur
1. Adenylatrest i branchpoint attackerar intronets 5 ́-ända via sin 2 ́-OH.
2. Fosfodiesterbindning i exon-introngräns bryts i en transesterfieringsreaktion.
3. Lariatintermediär bildas.
4. Exon 1 ́s fria 3 ́-OH attackerar intronets 3 ́-ända.
5. Transesterfieringsreaktion bryter fosfo- diesterbindning i intronets 3 ́-ända och återskapar fosfodiesterbindning mellan exon 1 och exon 2.
6. Intronet frisätts som lariatstruktur.
246
Spliceosomen
Spliceosomen katalyserar splicing
Är ett komplex av RNA (snRNAs) och proteiner (snRNPs)
Branchpoint binding protein (BBP) binder till branchpoint.
U1 snRNP basparar med 5 ́-splicesite, U2 snRNP basparar till branchpoint och initierar bildning av lariatstruktur.
Omstrukturering av spliceosomen skapar active site och positionerar splice-siten korrekt.
- Basparning mellan snRNA och mRNA:t är viktiga för korrekt splicing: BILD. komplex av snRNA och protein (snRNP) basparning mellan snRNA och mRNA är viktig
247
Alternativ splicing
- Ibland hoppas vissa exoner över. även alternativ splicing, är en RNA-splitsningsmekanism varvid en enskild gen kan ge upphov till olika proteinprodukter. Detta är möjligt genom att vissa exon i mRNA-transkriptet klipps bort medan andra är intakta, t.ex. i olika skeden i livet. det bestämmer kön och det är därför det är viktigt.
En viktig förklaring till varför människans c:a 25.000 gener kan koda för >100.000 proteiner.
Ex. 1 Könsbestämning i Drosophila: Alternativ splicin: (BILD)
248
Polyadenylering av 3 ́-ända
-Polyadenylering är en form av posttranskriptionsmodifiering av RNA. Den sker genom att en lång sekvens av adeninrester appliceras i slutet av mRNA-transkriptet. Denna så kallade poly-A-svans är ungefär 60 till 200 baspar lång, och tjänar till att påverka mRNA-transkriptets livslängd i cytosolen.
Sekvensen AATAAA nedströms om kodande sekvens i DNA översätts till AAUAAA i RNA.
Klyvning 10-30 nt 3 ́ om AAUAAA.
PolyA-polymeras adderar 100-200 A till RNA:ts 3 ́-ända.
Funktioner: Underlättar transport kärna→cytoplasma, mRNA stabilitet?
Viktig för translation (CAP+polyA= färdigt mRNA).
249
Processning av polyA svans
Efter addition av polyA-svans processas olika RNA till olika längd på svansen. Denna så kallade poly-A-svans är ungefär 60 till 200 baspar lång, och tjänar till att påverka mRNA-transkriptets livslängd i cytosolen.
250
Den genetiska koden - översättning från nukleotid - till aminosyrasekvens
Translation - Proteinsyntes
● Den genetiska koden är universell= Densamma i alla species
● En nukleotidtriplett i mRNA kodar för en aminosyra
● Koden är degenererad→Vissa aminosyror kodas av flera tripletter
● Läsramar, open-reading frames (ORFs)
251
Translation - Översikt
```
1- Amino acids activate
2- Chain itiation
3- Chain elongation
= Repeted many times --->
4- Chain Termination
```
252
tRNA
-viktiga: antikodon, 3 stycken niuklotider. och tre primenda som kopplar aminosyror.
● Är själva ”översättaren” från mRNA till protein
● Treklöver-struktur innehållande flera modifierade nukleotider (modifierar basparning) och regioner med dubbeltrådig sekvens.
● Antikodon, aminosyra-bindning i 3 ́-OH
253
Aminosyraaktivering
● Koppling tRNA-aminosyror katalyseras av aminoacyl-tRNA syntetaser. Ett syntetas/aminosyra.
● Syntetaserna känner dels av rätt tRNA via interaktion med antikodonloop, samt rätt aminosyra (se nedan)
● 2 ATP åtgår vid varje syntes
● ”Proofreadingmekanism” för translation: Syntetaserna har två active sites. Acyleringssite: bättre passform för ”rätt” aminosyra. Hydrolytiskt site bättre passform för ”fel” aminosyra.
Aminosyra + ATP → aminoacyl-AMP + PPi Aminoacyl-AMP + tRNA → aminoacyl-tRNA + AMP Aminosyra + ATP + tRNA → aminoacyl-tRNA + AMP + PPi
BILDDDDDD
254
Ribosomen
- Translation är den process i cellerna där ribosomerna använder mRNA för att bygga protein. Efter att DNA har transkriberats till mRNA, transporteras mRNA till en ribosom utanför cellkärnan. Ribosomen sätter sig runt mRNA och läser av kvävebaserna tre och tre (dessa tripletter kallas kodon).
● Utgör själva ”maskinen” för proteinsyntes
● Protein-rRNA komplex – 2/3 av massan är RNA
● Stor och liten subenhet
255
Proteiner syntetiseras i amino- till carboxylriktning genom att läsa av mRNA i 5 ́-3 ́ riktning
● Ribosomen har 3 sites: 1. A-site: aminoacyl-
tRNA.
2. P-site:Peptidyl tRNA 3. Exit
256
Proteinsyntesens tre steg: 1
-1. Initiering:
● Initieringsfaktorer, initierings-tRNAmet och lilla ribosomsubenheten binder till specifika strukturer i mRNA:ts 5 ́-ända
- Till CAP-strukturen hos eukaryoter - Till Shine-Dalgarno sekvensen (5 ́-GGAGGU-3 ́) i prokaryoter.
● Scanning till första AUG.
● Initieringsfaktorer dissocierar.
● Stora ribosomsubenheten binder
● tRNAmet (tRNAfmet i prokaryoter) i P site, nästa tRNA binder till kodon exponerat i A site.
Initieringsfaktorer: förhindrar att stora och lilla ribosomsubenheterna från att förenas utan att ha initieringsmetionin och mRNA bundet till sig.
257
Proteinsyntesens tre steg: 2
2. Elongering
● tRNA + aminosyra binder till exponerad triplett i A site via basparning.
● Katalys av petidbindning mellan aminosyra i P-site och aminosyra i A site. Spjälkning av tRNA-aminosyra bindning i P site. Reaktionerna katalyseras av peptidyl-transferas enzym.
● Katalysen utförs av rRNA i ribosomen.
● Translokering (förflyttning) av ribosomen. tRNA+aminosyra i A site hamnar i P site. Kräver GTP hydrolys.
● Flera ribosomer kan samtidigt sitta på ett mRNA: Polyribosom.
258
Elongeringsfaktorer
Tre stycken i prokaryoter:
1. EF-Tu + GTP binder till aminoacyl-tRNA.
- Skyddar aminoacyl-tRNA från hydrolys av esterbindning
- Förhindrar peptidbindning mellan aminosyra i P-site och A-site innan kontroll
skett att antikodon-kodon passar i A-site.
- Om antikodon-kodon matchar sker GTP hydrolys vilket möjliggör bildande av
peptidbindning mellan aminosyror i P- och A-site
2. EF-Ts
katalyserar dissociering av GDP från EF-Tu. EF-Tu binder nytt GTP. "profreading"
3. EF-G
är ett G-protein som möjliggör translokationen av tRNA och mRNA från A-site till P-site
Eukaryoter har liknande elongeringsfaktorer (eEF1 och eEF2)
259
Proteinsyntesens tre steg: 3
3. Terminering
● Tre st kodon (UAA, UAG, UGA) binder release
faktorer och ej tRNA.
● Bindning av release faktorer→konformations- förändring i peptidyltransferaset →H2O adderas till COO- i P site.
● Peptid, ribosomsubenheter, tRNA och mRNA dissocierar.
260
43 =64 st olika kodon finns.
43 =64 st olika kodon finns. Tre åtgår till STOP → 61 st kodon finns för 20 aminosyror. Lösning?
261
Wobble hypotese
● 1. Vissa a.s har flera tRNA
2. Basparningen mellan antikodonets 1:a position och
kodonets 3:e är mindre stringent → Basparningen
är endast beroende av de första två kodonen i tripletten medan den 3:e positionen kan wobbla.
● P g a wobbling finns endast 31 st tRNA i humana celler.
262
Proofreading
1. Två olika sites i aminoacyl-tRNA syntetaser (se tidigare)
2. tRNA i A site har EF-Tu + GTP bundet till sig.
Peptidbindning kan ej ske innan GTP hydrolys sker. GTP hydrolysen katalyseras av elongeringsfaktor.
Viss fördröjning av reaktionen →felaktigt bundna tRNA hinner dissociera innan peptidbindning skett.
263
Några skillnader mellan eukaryoter och prokaryoter
1. Eukaryota ribosomer är större
2. Första aminosyran är formylmetionin i prokaryoter och metionin hos eukaryoter.
3. Prokaryoter startar translation på första AUG efter SD-sekvensen. Eukaryoter startar på första AUG efter CAP-struktur.
264
Funktion hos antibiotika
Många antibiotikum utnyttjar skillnaden i mekanismer mellan prokaryoter och eukaryoter: (BILD)
265
Post-translationella modifieringar
-Borde ibland kallas ko-translationella modifieringar
-Vissa proteiner är funktionella efter att de lämnar ribosomen, andra genomgår modifieringar som resulterar i:
- Aktivering till funktionell form
- Transport till korrekt subcellulär lokalisation - Sekretion
Information om post-translationella modifieringar ligger alltid i proteinets primärstruktur (=aminosyrasekvens)
266
Disulfidbindningar
Katalyseras av disulfidisomeras i ER.
Nästan alla cysteiner som exponeras på cell-ytan eller mot organellers insida, är disulfidbundna
Cytoplasman är en reducerande miljö →få S-S bryggor.
Stabiliserar, förhindrar membrantranslokering, ger aktiv tertiärstruktur (t ex insulin)
267
Hydroxylering av proliner/lysiner i kollagen
Skörbjugg orsakas av Vitamin C-brist. Vit. C krävs för att enzymet prolyl hydroxylas ska vara aktivt
~Var 3:e aminosyra i prokollagen är glycin
Hydroxylysin och hydroxyprolin stabiliserar trippelhelixbildning i kollagen
268
Bindning av prostetiska grupper
En prostetisk grupp är ett koenzym som är mer eller mindre permanent bunden till ett enzym eller annat protein. Prostetiska grupper skiljer sig från koenzymer genom att prostetiska grupper är hårdare bundna (till exempel hem-gruppen i hemoglobin) – de kan till och med vara bundna med en kovalent bindning.
(BILD)
269
Proteolys – t ex zymogen-aktivering av insulin
Insulin syntetiseras som pre-proinsulin →ER-signal.
Proteolys av signalpeptid i ER →proinsulin → veckning av protein →bildande av ”rätt” disulfidbryggor.
Transport till GA →packning i sekretoriska granulae →utklyvning av intern C-peptid →aktivt insulin.
Proinsulin kan denatureras – renatureras, ej insulin.
Proteolytiska enzymer syntetiseras ofta i inaktiv prekursor- form som aktiveras med proteolytisk klyvning. → Amplifieringsmöjlighet (t ex koaguleringskaskad)
samt skydd mot okontrollerad proteolys.
270
Sekretoriska proteiner-translokering
Proteiner som ska exporteras ur cellen, eller byggas in i membraner syntetiseras med en N-terminal signalpeptid.
En signal recognition particle (SRP) binder till signalpeptiden → translationen avstannar.
Ribosom + signalpeptid + SRP transporteras till endoplasmatiska retiklets (ER) membran
Interaktion mellan SRP-receptor och ribosom-receptor inducerar bildande av por i E.R membran
GTP hydrolys av GTPaser i SRP och SRP-receptor → konformationsförändring → SRP + receptor lossnar
Translation återupptas.
Translation och translokering genom ER-membranet skersamtidigt.
271
Sekretoriska proteiner-translokering och Sekretoriska proteiner
(BILD)
Proteinet är membranbundet via signalpeptid efter translokering.
Frisättning m h a membranbundet signalpeptidas.
Efter frisättning: Veckning av protein.
Proteiner som ska stanna i ER har speciella ER retentionssignaler.
272
Membranbundna proteiner
(BILD)
Membranbundna proteiner
Proteiner som ska passera membranet en gång innehåller en signal för att upphöra med translokering
273
Membranbundna proteiner
Proteiner som passerar membraner flera gånger har flera start/stop translokerings- signaler.
Den del av proteinet som är cytoplasmatisk i ER blir även cytoplasmatisk efter transport till andra organeller.
274
Glykosylering av proteiner
Är en viktig typ av prost-translationell modifiering av proteiner, Men har täckts av tidigare föreläsningar av Thomas Borén under avsnittet kolhydrater
275
Fosforylering
Specifika enzymer (kinaser) adderar fosfatgrupper till OH-grupper på Ser, Thr, Tyr.
Ex. Cyclin-dependent kinases (cell-cykelreglering), TFIIH-CTD of RNA polII (transkription) Exempel på Thr,Ser fosforylering: se glykogenfosforylas
Kinaser + fosfataser (tar bort fosfatgrupper) reglerar tillsammans aktiviteten hos flera enzymer. Fungerar som av/på-knapp för enzymaktivitet.
- Många tillväxtfaktorer, receptorer och onkoproteiner är tyrosinkinaser
276
Proteinnedbrytning i lysosomer
Lysosomer endocyterar proteininnehållande ”coated vesicles” via clathrinmedierat upptag.
Sur miljö + lysosomala proteaser →nedbrytning
277
Proteinnedbrytning via ubiquitinering och proteasomkomplex
(bild) (BILD)
E1 – Ubiquitinaktiverande proteinkomplex
E2 – Ubiquitin-bärande proteinkomplex
E3 – Ubiquitin-protein ligas
278
Ubiquitin
76 aminosyror lång peptid.
Binder till NH2-grupp i lysiners sidokedja i vissa proteiner→transport till proteasomen→klyvning av ubiquitin-bundet protein till små peptider
279
processen reglade by protein degredation
(BILD)
280
20 amigo syror
```
Serine, polär och oladdad
Glycine, ickepolär och hydrofobisk
Threonine, polär och oladdad
(W)Thryptophan, ickepolär och hydrofobisk
(Y)Tyrosine,polär och oladdad
Alanine, ickepolär och hydrofobisk
Methionine, ickepolär och hydrofobisk
Alanine, ickepolär och hydrofobisk
(K)Lysine, basisk
(D) Aspartic Acid, sur
Proline, ickepolär och hydrofobisk
E) Glutamic acid, sur
```
281
Hur uppstår substitutioner och deletioner?
Repeterande sekvenser i DNA och Då kan det hamna på fel hål och orsaka problem/fel
282
Katalysator:
Ämne som ökar hastighet på en reaktion utan att själv förbrukas
283
Enzymer: vad de gör och deras funktion:
1- Katalysator: Biologiska system
2- Bestämmer vilka reaktioner som sker i cellen
3- Oftast protoner, Ibland Ena (Tex: Ribosomer)
4- Enzymer kan öka reaktion hastigheten. Mycket effektiv reaktions hastighet kan öka 10 till 15 gånger. (Motsvarar 30 miljoner år till en sekund)
5- Mycket specifika (ett enzym, en reaktion) som Tex: stereospesifika. Vii behöver olika enzymer i cellen (1/3 av genomet kodar för enzymer)
6- De är reglerbara. ------>
(1) -Det finns öka aktiviteten gradvis)
(2) -Mekanismer i cellen ---> sätta på/av enzymer (binär) - modifiering = fosfalering
(3) -Mänden av enzymer regleras i cellen
284
```
(Enzym bild) med=
"REaction",
"K",
"E",
"Active site"
```
```
1- E= Enzym
2- K= Kofaktor, Tex. Metaljon eller organisk molekyl (För vissa enzymer)
3- Aktive site = Aktiva Ytan: ---->
-Här sker reaktionen
- Ger enzymet dess specificitet
- Aktiva ytan byggs av sidkedjor
```
285
Eventuella kofaktor
- Kofaktor kallas för även för "koenzym"
- Kovalennt bundet kofaktor kallas "protetisk grupp"
- För enzym med kofaktor: "apoenzym" E (utan kofaktor)
(Några enzymer behöver och några "holoenzym" E+K behöver ej kofaktor)
286
TYPreaction
S P
- S: Substrat = Reaktant
- P: Produkt = Det som bildas
- Vmax= är en konstant
- Vmax= Konstant x Enzym
- Vmax= Kcat x Enzym
- Kcat= (Hur snabbt enzymet kan arbeta) Maxhastighetern oberoende av Enzym. Hur många molekyler produkt en enskild enzymolekyl maximalt kan producera per sekund. unikt för varje enzym.
- K= Jämnvikt Konstant
- k= Hastighet Konstant
- Km= Beskriver hur väl enzymet binder substrat.
- akveringenergi = Den energi som krävs för att starta en viss process eller kemisk reaktion.
- Transitionstate = Energi maximum overgångs tillstånd
Exergon Reaction: Kallas ibland "Spontan" är en spontan kemisk reaktion. (formel)
- Enzymer ändrar ej jämnviktkonstanten
287
Michaelis-mentans kinitik (BILDERRRR) (Ekvationer)
Michaelis–Menten-kinetik beskriver approximativt enzymkinetiken för många enzymer, d.v.s. hur deras arbetstakt är relaterad till koncentrationen av substrat och enzymets maximala hastighet. Kinetiken är uppkallad efter biokemisterna Leonor Michaelis och Maud Menten.
288
Högt och Låg Km
- Högt Km Lätt dissociation av ES Svagbinding (E till S)
| - Lågt Km Svår dissociation av ES Stark bindning
289
Reglering av Enzym aktivitet
● 1- Tillgång på substrat (t.ex. transport in/ut ur organeller)
● 2- Tillgång på enzym (aktivering av gen, eller nedbrytning) tar minuter eller timmar.
● 3- Aktiviteten av enzymet ( kan ibland ske på c, 1 sek)
Kovalent reglering=
-3a(i)- Kemisk modifiering av aminosyror. Vanligast är FOSFORYLERING: överföring av en fosfat grupp från molekylen ATP, till sidokedjor på serie, treonin, tyrosin. (BILD och FORMEL)
-3a(ii)- proleolytisk reglering. (proteolys: Brytning av peptidbinding) Enzymer kan bildas som inaktivt förstadie (processor) och sen aktiveras när de klyvs av proteas ( en enzym som bryter peptid bindning) T.ex. hos enzymer i matspjälkningen.
-3b-
Alloster reglering= (Annat ställe= Alloster) (BILD/PAPPER)
- Binding av effector molekyl alster yta kan antigen aktivera eller hämma enzymer.
- Strukturen på aktiva ytan ändras av effectors bindning
Kooperativitet=
- Ett Special fall av allosteri
- Kräver multipelt enzymkomplex (var sin har sin aktiva yta (BILD/PAPPER)). Binding av sonenhet ---> S binder lättare till andra subenheter. T.ex. Hemoglobin - homotetramer. O2 binder lättare till en subenhet om de andra redan bundit O2.(BILD/PAPPER)
● 4- PH/Tempratur= Tempratur: används sällan för reglering, men påverckar Enzymer aktivitet. Varje Enzym har ett temperatur - och PH-optimum Kcat.
● 5- Inhibering av aktivitet (Inhibering= hämning) (Inhibitor (hämmare): molekyl som sänker eller helt står av ett Enzym aktivitet
- Irreversibel inhibitor: Binder kovalent till Enzym står av e-molekyler permanent. T.ex. acetylsalicylsyra
- reversibel inhibitor: Hämmar Enzym när den är bunden, men kan lossna igen (och vise versa). T.ex. Kompetitiv inhibitor: En reversibel inhibitor som tävlar med substratet om att binda Enzym
290
enzym klasser
- EC 1: Oxidoreduktaser (katalyserar redoxreaktioner).
- EC 2: Transferaser (transporterar funktionella grupper mellan donator och acceptor).
- EC 3: Hydrolaser (katalyserar hydrolysreaktioner – addering av H2O till en kemisk bindning).
- EC 4: Lyaser ("sönderbrytare", bryter vanligtvis sönder en C-C bindning, men kan även bryta C-N eller frigöra CO2 från en beta-ketosyra. Detta sker i form av en exoterm reaktion).
- EC 5: Isomeraser (heterogen grupp enzymer som katalyserar flera olika typer av isomerisationsreaktioner – flyttar en grupp eller en dubbelbindning inom samma molekyl).
- EC 6: Ligaser (Sätter samman två kolatomer i en endoterm reaktion).
