Caracterización de patógenos por secuenciación Flashcards
Proceso que determina la secuencia de bases de los nucleótidos (As, Ts, C, y Gs) de un fragmento de ADN
Secuenciación
Es el método de secuenciación por terminación de cadena
Sanger
*estándar de oro para validación de otras secuencias por métodos nuevos
Componentes del método Sanger
- Enzima de ADN polimerasa
- Cebador
- Cuatro nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
- Molde de ADN que será secuenciado
- Versiones didesoxi o terminadores de cadena (de los cuatro nucleótidos)
¿Cuál es la característica principal de las versiones didesoxi?
No tienen grupo hidroxilo en el carbono 3’ del anillo de azúcar
*pigmento: se une a la base nitrogenada
¿Por qué ya no se pueden añadir nucleótidos a la cadena al unirse didesoxi?
No tiene grupo hidroxilo en carbono 3’, en el que deberían añadirse los nucleótidos
Describe los pasos del método Sanger (4)
- Se calienta mezcla para desnaturalizar molde de ADN y luego se enfría para que cebador se una al molde de cadena sencilla.
2.↑ temperatura para que la ADN polimerasa pueda sintetizar ADN nuevo a partir del cebador. - Añade nucleótidos a cadena hasta que aleatoriamente agregue un didesoxi en lugar de uno normal.
- Ya no es posible agregar más nucleótidos y la cadena termina con nucleótido didesoxi.
Se realizan varios ciclos. Tubo contendrá fragmentos de diferentes longitudes.
¿Cómo funciona la electroforesis capilar?
- Se añaden marcadores fluorescentes, los extremos tendrán el pigmento que indica su nucleótido final.
- Se leen de abajo hacia arriba (las de abajo son las más cortas, son las primeras de la secuencia porque la cadena recorrió poco y se detuvo).
Es la disciplina evolutiva para el descubrimiento de orígenes de enfermedades y parentesco de microorganismos.
Filogenética
Describe los distintos componentes de un árbol evolutivo (6)
- Raíz: origen ancestro en común
- Rama: unen nodos internos.
- Nodo interno: ancestros comunes que comparten ≥2 taxones.
- Nodos terminales: organismos de interés a estudiar
- Taxones hermanos: comparten ancestro en común reciente
- Outgroup: menos emparentamiento con los taxones, más lejanamente emparentado a nuestros taxones de interés.
En VIH, ¿de qué actividad carece la retrotranscriptasa?
Exonucleasa 3’-5’
Que actuaría como correctora de errores.
Es cualquier cambio que mejore la replicación del VIH en presencia de un inhibidor.
Resistencia
Se basan en el análisis del genoma, detectan la presencia de mutaciones.
Pruebas genotípicas comerciales
El fundamento de esta técnica es una hibridación reversa post-PCR.
LiPA
Una ventaja de esta técnica es que permite el análisis simultáneo de un elevado número de muestras.
Genechip
¿Cómo es la técnica de las pruebas fenotípicas para la detección de resistencias a antivirales?
- Las pruebas fenotípicas consisten en un sistema de replicación in vitro que enfrenta al virus con diferentes concentraciones de fármacos antirretrovirales
*grado de inhibición del crecimiento se establece por comparación con una cepa de referencia
