C10 Flashcards
Source de cellules pour études biochimiques
1- Cultures primaires
✅:
-Plus représentatifs des réalités tissulaires.
-Access aux cellules d’animaux génétiquement modifiés.
❌:
-Difficile à isoler et faire pousser. -Faible rendement.
-Coûts plus élevés.
2- Lignées cellulaires
✅:
-Possibilité de production en quantité élevé.
-Disponibilité commercial d’un grand éventail de type cellulaire.
-Moins dispendieux.
❌:
-Moins représentatifs des réalités tissulaires. -Cellules transformées.
Visualisation de protéines in situ (2)
- Microscopie à epifluorescence
—> Excitation et détection de la fluorescence en lumière transmise
• échantillon est illuminé de manière uniforme, et la lumière émise est détectée après avoir traversé l’échantillon
- Microscopie confocal (meilleure résolution)
—> Excitation et détection avec un laser, élimination de la lumière hors-focus
• Permet d’obtenir des images très nettes et détaillées en éliminant la lumière hors-focus grâce à une optique à balayage
microscopie à épifluorescence est idéale pour des observations simples et rapides, tandis que la microscopie confocale est préférée pour des analyses plus détaillées et profondes, en particulier pour des échantillons plus épais et lorsque des images en 3D sont nécessaires
Isolation cellulaire (3)
1- Fluorescence activated cell sorter (FACS)
• marquage des c (avec Ac ou sondes fluo. Spécifiques)
• analyse par cytometrie de flux
• tri des c (En fonction de la fluorescence détectée)
—> c sont séparées dans différents réservoirs selon leurs caractéristiques (taille, granularité, type de fluorescence)
- Micro-dissection par laser
—> échantillon (tissu) sur lame observé au microscope
—> marquage spécifique et micro-dissection par laser
—> c ciblées sont isolées - Identification du transcriptome unique dans chaque c d’un tissu
—> l’analyse détaillée des ARN exprimés dans chaque cellule individuelle au sein d’un tissu
—> Drop-seq et InDrop sont des techniques où chaque cellule est isolée dans une gouttelette d’huile avec des billes portant des séquences d’ADN spécifiques. Ces billes capturent l’ARN de chaque cellule et permettent le séquençage de son transcriptome
Purification de protéines (2)
-
Fractionnement Cellulaire
• Ultracentrifugation: separation par taille et densité
- La centrifugation est la première étape de fractionnement c.
- Sépare les fractions principalement selon le poids.
- Plusieurs débris non-spécifiques se retrouvent dans chacune des fractions
• Centrifugation par vélocité vs densité
- vélocité :
composant de la cellule fractionnée vont se déposer en bandes principalement selon leur poids et leurs forme (coefficient S)
s=vt/a
(vitesse de sédimentation de la particule/ accélération)
-densité:
Chaque composent cellulaire descend le gradient et s’arrête à la densité de la solution correspondant à sa propre densité
Méthode très sensible pouvant séparer les macromolécules qui on incorporé des isotopes plus légères (ie 13C ou 15N).
2- Separation par chromatographie
protéines sont immobilisées (ou ralenties) suite aux interactions avec la matrice de la colonne
Matrices:
-échange ionique
- filtration gel (taille :protéines de plus grande taille sortent en premier)
- affinité
Identification de protéines méthodes
1- Insertion d’un “Tag” pour faciliter la purification et/ou la localisation cellulaire de protéines
(Ex . His-tag (Nickel), c-myc-tag (Ac) , GST-tag (glutathione))
2- Purification de complexe protéiques à l’aide d’un « tag »
(Chrom. Affinité)
3- SDS-PAGE: sodium dodécyl sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis
(& b-mercaptoerhanol - ponts disulphure)
a) Gel de Coomassie et de nitrate d’argent
(deux techniques couramment utilisées pour la coloration et la visualisation des protéines après électrophorèse sur gel)
b) Immunobuvardage de type Western: Transfert de protéines - détection des protéines avec Ac
4- Séparation de protéines selon le point isoélectrique : séparation en 2D
—> 1er séparation selon la charge intrinsèque de la protéine (dans tampon avec détergeant non- ionic) avec beta −mercaptoethanol et urée. La séparation se fait selon un gradient de pH (isoelectric focusing): le polypeptide se déplace jusqu’au pH où il n’a plus de charge.
-2e séparation: électrophorèse (avec SDS selon la taille) à angle droit à la première séparation
5- identification des protéines par spectrométrie de masse
MALDI-TOF
Matrix-assisted laser Desortion ionization-time-of-flight spectrometry
1- Matrix assisted: La protéine est premièrement fragmentée (trypsine) et séchée à l’aide d’un acide organique (cristallisé) sur une matrice de métal ou céramique.
2- Laser Desorption: Un laser percute l’échantillion et projette les peptides sous forme de gaz ionisé. Chaque molécule à une ou plusieurs charges positives.
3- Les ions sont accélérés à des hautes vitesse dans un champs de haut voltage électrostatique vers le détecteur .
4- Time of Flight: La masse et la charge de chaque peptide dicte le temps de vol avant d’arriver au détecteur. Les large peptides volent lentement et les peptides hautement chargés, volent rapidement.
5- Cette information est ensuite utilisé pour chercher dans les bases de données génomique où se trouve les masses de tous les protéines connues ainsi que les masses des fragments de ces protéines.
TECHNIQUES D’ÉTUDE DES INTERACTIONS PROTÉINES-PROTÉINES (3)
1- CO-IMMUNOPRÉCIPITATION
2- INTERACTION IN VITRO (PULL-DOWN)
I- CONSTRUCTION DES PROTÉINES HYBRIDES ET EXPRESSION DANS E. coli (À et B)
II- PURIFICATION DES PROTÉINES HYBRIDES
III- CLIVAGE ET PURIFICATION DE LA PROTÉINE B
IV-DETERMINATION DE L’INTERACTION ENTRE A ET B
• ANALYSE DU SURNAGEANT PAR SDS-PAGE
—> si le surnageant ne contient pas B = interaction entre À et B
—> si le surnageant le contient = pas d’interaction entre À et B
3- MUTANT DOMINANT NÉGATIF
—> perturbe spécifiquement les complexes protéiques ou les voies de signalisation.
—> permet d’isoler l’effet d’une protéine mutée sur d’autres protéines interagissant avec elle, facilitant ainsi la compréhension des réseaux de signalisation cellulaire et des mécanismes biologiques sous-jacents
Quantification d’interactions biomoléculaires (3)
1- Résonance plasmon de surface
2- Fluorescence resonance energy transfer (FRET)
3- Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)
Résonance plasmon de surface (SPR)
détecte les interactions de liaisons en analysant la réflexion d’une onde de lumière projeté sur l’interface d’une solution aqueuse contenant des ligands potentiels et une surface avec une protéine cible immobilisée
—> liaison d’un ligand à la protéine immobilisé sur le film métallique change la composition des complexes moléculaires de la surface métallique et par conséquent change l’angle de résonnance
changements d’angle de résonnance sont enregistrés en temps réel.
—> permet l’identification de nouveaux ligands pour des récepteurs connues
FRET
Fluorescence resonance energy transfer
BRET
Bioluminescence Resonance Energy Transfer
one protein is made to produce light (bioluminescence), and this light can transfer energy to another nearby protein, causing it to emit light too.
This transfer happens only if the two proteins are close enough to interact with each other.
Measurement:
By measuring the light emitted by both proteins, scientists can tell if the proteins are interacting or not.
Quantum dots
small semiconductor particles that emit bright, stable light, and their size determines the color of light they emit.
—> In BRET, quantum dots can be used as the acceptor molecules, taking the energy from a donor molecule (like luciferase) and emitting light at a different wavelength
—> enhance the sensitivity and flexibility of BRET assays
Absorbe la lumière bleu
-Emettent une longueur d’onde selon leur diamètre: plus le QD est grand, plus la longueur d’ondes émisse est longue.
-Fluorescence persiste pendant des semaines; nettement plus long que des fluorophores classiques.
Interaction protéine-chromatine
—> Comment determiner la cible d’un facteur de transcription?
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
• Crosslink proteins to DNA.
• Shear chromatin into smaller pieces.
• Immunoprecipitate with an antibody to pull down the protein-DNA complex.
• Wash to remove non-specific interactions.
• Reverse crosslinks to release DNA.
• Purify DNA.
• Analyze the DNA regions bound by the protein.
ANIMAUX TRANSGÉNIQUES
• remplacement du gène
• KO du gène
—> modèle entier ou dans une sous-population de c
—> à un temps spécifique via induction (CreER/loxP système)
• addition d’un gène muté (knock-in)
—> garde les 2
