Biotechnologies microbiennes Flashcards
C’est quoi la biotechnologie?
Les organismes vivants sont manipulés par le biais de la génétique moléculaire
Technologie de l’ADN recombinant?
Méthodes qui permettent la modification délibérée de l’information génétique d’un organisme
Principe du clonage? (2 étapes)
- Le fragment d’ADN à cloner est introduit dans un vecteur de clonage
- Le vecteur recombiné est ensuite introduit dans un organisme hôte ou il va être répliqué
Production d’ADNc utilise quel enzyme?
transcriptase inverse
L’ADN obtenu par synthèse chimique provient de quoi?
Une synthèse chimique automatisée artificielle qui peut être effectuée si on connait la séquence du gène à synthétiser
Étapes du clonage?
- Préparation du vecteur et de l’ADN d’intérêt
- Jusqu’à 2 enzymes de restrictions sont nécessaires pour l’insertion d’un fragment d’ADN
- Construction du vecteur recombinant (vecteur)
- Insertion du plasmide recombinant dans l’organisme hôte
C’est quoi le but de l’étape 4 du clonage?
amplifier chaque ADN recombinant à l’aide de la machinerie bactérienne
l’ADN recombinant ligaturé pénètre dans une cellule bactérienne par ______
transformation
Comment le vecteur plasmidique est capable de se répliquer?
les plasmides possèdent habituellement une origine de réplication
Pourquoi le clonage des gènes exprimés par l’organisme hôte des procaryotes est problématique?
Comment résolver ce problème?
Les organismes procaryotes n’ont pas la machinerie nécessaire pour retirer les introns pendant la maturation de l’ARNm
-Solution : transcriptase inverse
Southern et Northern déterminent si : (2)
- Un individu est porteur du gène ou plus précisément de l’allèle qui aura préalable été cloné
- Déterminer si le gène en question est exprimé sous certaines conditions
Southern?
Détection de fragments d’ADN d’intérêt au travers des nombreux fragments produits par la digestion par l’enzyme de restriction
5 étapes du Southern
- ADN digéré par enzyme de restriction
- ADN est séparé par électrophorèse
- Filtre fixant l’ADN, des serviettes et un poids sont placés sur le gel
- Met le filtre dans un sachet avec solution contenant sonde
- Filtre est lavé pour enlever excès de sonde et placé sur un film pour rayons X pour voir bandes d’ADN
PCR : enzyme?
Taq polymérase
Taq : isolé de quelle bactérie?
Thermus aquaticus
3 étapes du PCR
- Dénaturation à 95°C
- Hybridation : amorces s’hybrident à leurs séquences complémentaires
- Élongation à 72°C : par ADN Pol
4 grandes types de vecteurs de clonage
Plasmides
Vecteurs phagiques
Cosmides
Chromosomes artificiels
Vecteurs phagiques :
Génomes de _____
Le gène cloné peut être introduit à une fréquence ____
Clone des fragments de tailles _____
- phages modifiés génétiquement
- élevée
- définies
Cosmides :
Naturelle ou synthétique?
Leur ADN peut se répliquer dans la cellule comme _____ et empaqueté comme ______
Servent à cloner des fragments de quelle taille?
- Synthétique
- Plasmide
- Phage
- plus de 45kb
Chromosomes artificiels :
clonent fragments de quelle taille?
Très larges
3 régions d’un vecteur de clonage
Origine de réplication
Marqueur de sélection
Multisite de clonage
Origine de réplication permet quoi?
la réplication du plasmide dans la cellule hôte indépendamment du chromosome bactérien
Marqueur de sélection permet quoi?
différencier les cellules qui ont pris le vecteur (cellules transformées) de celles qui ne l’ont pas pris
Multisites de clonage contient quoi? Essentiel à quoi?
Contient sites de restriction qui ne se trouvent qu’une fois dans le vecteur de clonage.
Essentiel à l’insertion d’ADN étranger.
L’insertion d’ADN recombinant se fait par : (2)
Transformation
Électroporation
Transformation?
forcée, cellules rendues compétentes et artificiellement transformées par choc thermique
Électroporation?
appliquer une brève impulsion électrique qui rend les membranes perméables pour absorber l’ADN étranger
Le gène étranger a besoin d’un ____ pour être transcrit?
promoteur
En plus du promoteur (pour expression du gène étranger, les modifications incluent l’ajoute de _______
marqueurs
Marqueurs (pour expression des gènes étrangers) permet de faire quoi?
purifier ou détecter facilement les protéines recombinantes
3 principes du marquage poly-His?
- Ajoute d’une série d’histidines au N ou C-terminale de la protéine
- Forte affinité pour les résine avec ions métalliques
- Protéines marquées sont retenues et éluées par la suite pour enlevé le marqueur grâce à une enzyme
Fusion transcriptionnelle permet d’étudier quoi?
On remplace le gène dont on veut connaitre la régulation par quel gène?
L’expression de la protéine est sous contrôle du ______
- La régulation d’un gène
- le gène qui code pour une protéine fluorescente
- promoteur du gène qu’on veut étudier
Fusion transductionnelle : création d”une protéine chimérique comment?
Par l’ajout de la séquence du gène qui code pour une protéines fluorescente à celle du gène codant pour la protéine d’intérêt.
Système BAC to BAC permet de produite quoi?
baculovirus recombinants plus efficacement qu’en partant de virus purifiés puis transformés
Le BAC to BAC est utile comme ______
insecticide biologique d’insectes nuisibles
Édition génomique?
4 types de ciseaux moléculaires?
Modification du génome grâce à l’utilisation d’endonucléases
- Nucléases à doigt de zinc
- Méganucléases
- Système CRISPR-cas9
- Nucléases effectrices de type activateur de transcription
Les ciseaux moléculaires sont toutes _____. Ils incluent ____ et une ____.
Exception?
- artificielles
- une nucléase qui coupe l’ADN
- une protéines qui cible une séquence bien précise du génome
- Méganucléase
CRISPR-cas9:
Quelle sorte d’ADN?
Si la cellule rencontre de nouveau un ADN étranger identique …. ?
- ADN viral double-brin intégrés dans des locis particuliers (loci CRISPR)
- …, l’ADN sera reconnu et détruit par des enzymes
CRISrPR-cas9:
formation du complexe?
2 courts ARN (crARN et tracrARN) forment un ARN guide. Cette paire forme une complexe avec cas9, une nucléase ARNdépendante
TALENs sont des enzymes constitués de la fusion de deux éléments : ?
- Une partie capable de reconnaitre une portion d’ADN spécifique (partie TALE)
- Une autre capable de couper le brin d’ADN (partie N pour nucléase FokI)
Les TALEs sont des protéines découvertes chez quelles bactéries?
bactéries phytopathogènes
Les TALEs possèdent quelle domaine ?
domaine central constitué de répétitions de 34 acides aminés identiques à l’exception des acides aminés 12-13, qui correspondent à un nucléotide précis
