Biología Molecular Flashcards
- fraccionamiento de ácidos nucleicos - 2 tipos
electroforesis en gel, ultracentrifugación (sedimentación)
Separación de DNA por electroforesis en gel
La separación de moléculas de DNA mayores de 25 kb suele hacerse mediante la técnica de electroforesis en campo con pulsos en la que la dirección del campo eléctrico en el gel se cambia en forma periódica, lo que ocasiona que las moléculas de DNA se reorienten durante la migración.
Todos los fragmentos de DNA que están presentes en un gel pueden revelarse mediante
mediante la inmersión del gel en una solución de bromuro de etidio para luego observar el gel con luz ultravioleta.
Separación de ácidos nucleicos por ultracentrifugación
Separación de moléculas de DNA de diferente tamaño por la VELOCIDAD de sedimentación
Separación de las moléculas de DNA por sedimentación de EQUILIBRIO con base en las diferencias en la composición.
La sedimentación por velocidad
las moléculas de ácido nucleico se separan según la longitud del nucleótido
A mayor coeficiente de sedimentación, (velocidad)
más lejos se mueve la molécula en un periodo determinado de centrifugación.
La centrifugación de equilibrio (o isopícnica)
las moléculas de ácido nucleico se separan según su densidad de flotación.
- Hibridación de ácido nucleico
el adn debe ser monocatenario - membrana nitrocelulosa - sondas marcadas
Para llevar a cabo la hibridación…
los fragmentos fraccionados de DNA se desnaturalizan y transfieren a una membrana de nitrocelulosa, que se incuba con sondas de DNA (o RNA) con marca radiactiva o fluorescente.
proporciona una medida de la similitud en la secuencia de nucleótidos entre dos muestras de DNA,
Hibridación de ácido nucleico
dos moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla con secuencia de bases complementaria pueden formar
un híbrido de doble cadena.
- síntesis química de DNA
Si se requiere una molécula de doble cadena, se sintetiza como dos cadenas complementarias que pueden unirse entre sí por hibridación. Las moléculas sintéticas de mayor longitud se elaboran en segmentos que se unen
en la actualidad la
síntesis de oligonucleótidos se realiza mediante
mediante máquinas controladas por computadora
conectadas a depósitos de reactivos.
- Tecnología de DNA recombinante
El DNA recombinante puede usarse en diversas formas.
Para empezar, se considera una de las aplicaciones más
importantes: el aislamiento del genoma de un
segmento particular de DNA que codifica un
polipéptido determinado.
2adn-fuentes diversas
qué son las moléculas de ADN recombinante
son moléculas que contienen secuencias de DNA derivadas de más de una fuente.
Ejemplo de clonación de DNA con plásmidos bacterianos.
El DNA se extrae de células humanas, se fragmenta con EcoR1 y los fragmentos se insertan en una población de plásmidos bacterianos.Una vez que la célula bacteriana captó un plásmido recombinante del medio, la célula da origen a una colonia de células que contienen la molécula de DNA recombinante.
- Amplificación enzimática de DNA por reacción en cadena de la polimerasa
✓ Amplificación de DNA para clonación o análisis
✓ Pruebas para la presencia de secuencias de DNA específicas
✓ Comparación de moléculas de DNA
✓ Cuantificación de moldes de DNA o RNA
- faros moleculares
PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa
amplifica pequeños segmentos
Cómo se hace la amplificación por PCR
adaptar a los moldes de RNA si primero se les convierte en DNA complementarios, con transcriptasa inversa.
resistente al calor
Con cada ciclo de duplicación, las cadenas se separan, los segmentos de flanqueo (cebadores) se
unen con los extremos de la región seleccionada y la polimerasa copia el segmento intermedio
cómo se muestra que la PCR es positiva?
los cebadores PCR se hibridarán con él y la PCR generará un producto
- Secuenciación
de DNA
✓Sanger-Coulson
✓Secuenciación paralela
masiva (2a generación)
✓Actuales (3a generación)
la secuenciación de Sanger-Coulson y PCR se fusionaron en una
técnica de secuenciación
método de secuenciación cíclica:
PCR y Sanger-Coulson
combina los aspectos bioquímicos del primer método con los ciclos repetitivos del segundo
moléculas hijas con marca fluorescente se separan, se lee la intensidad y longitud de onda de la luz fluorescente, por electroferogramas
Secuenciación paralela masiva (o secuenciación de la segunda generación)
- no se clona
-se preparan directamente los fragmentos a partir del genoma en su totalidad y cada uno es amplificado más adelante hasta formar una población abundantísima.
-síntesis de DNA dependiente de polimerasa, - logran la identificación directa de nucleótidos individuales a medida que son incorporados por las polimerasas, en tiempo real.
Secuenciación de DNA Actuales (3a generación)
- La identificación de nucleótidos se basa en las diferencias de propiedades iónicas de los cuatro nucleótidos que se detectan, conforme cada uno pasa, uno tras otro a través del nanoporo - muy rápido -
- secuenciación por síntesis, –fluorescencia, incubación, corridas.
- Genotecas de DNA
Colecciones de fragmentos de DNA clonado
- Genotecas genómicas (fago lambda , YAC
y BAC) - Genotecas de cDNA (transcriptasa inversa)
genotecas genómicas
1.2 enzimas (HaeIII y Sau3A) de restricción , reconocen secuencias muy cortas y susceptibles, para dividirla, se digiere, se fracciona, se incorpora ne las partículas de fago
para qué sirven las pariculas de fago
para generar el millón de placas necesarias para asegurar la representación de cada segmento individual de un genoma de mamífero.
YAC- genotecas genómicas
cromosoma artificial de levadura
acepta segmentos ADN x 1 millón de pares de bases
BAC- genotecas genómicas
cromosoma artificial bacteriano
acepta segmentos ADN 500 bases, factor F, + velocidad
Genotecas de cDNA
se aísla una población de RNA mensajeros y se utiliza como plantilla para que la transcriptasa inversa forme una población de híbridos DNA-RNA
la clonación de cDNA sirve para
análisis de la expresión genética y el corte y empalme alterno.
- Transferencia de DNA a células eucariotas y embriones de mamífero
Se incorpora el DNA en el genoma de un virus que no está en replicación y permitir que el virus infecte una célula
La transferencia de genes mediada por virus se conoce como
transducción
retrovirus modificados
contienen un genoma de RNA que se transcribe a la inversa en DNA dentro de la célula.
células se incuban con DNA en ampolletas especiales que contienen electrodos que aplican un pulso eléctrico breve
electroporación
las células se tratan con DNA que se une con lípidos de carga positiva (liposomas catiónicos) capaces de fusionarse con la bicapa lipídica de la membrana celular y llevar el DNA al citoplasma
lipofección
Microinyección directa de
DNA en el núcleo celular.
forma + directa de introducir genes ajenos a una célula
núcleos de los oocitos y huevos
Una forma de introducir genes ajenos consiste en incorporarlos en el plásmido Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens
induce la formación de agallas-masas tumorales-
se aisla de bacterias, para producir plásmido recombinante, transforma células vegetales
Las células vegetales pueden servir como blancos para pelotillas microscópicas de tungsteno cubiertas con DNA que se disparan…
con una pistola de genes
para introducir genes ajenos en las células de las plantas monocotiledóneas
pistola de genes técnica que se emplea para-
para modificar el material genético de varios tipos distintos de células vegetales.
- Edición y silenciamiento génico
- avanzada
-inversa
Genética de avanzada-
aprendizaje de los
genotipos mediante el estudio del fenotipo mutante
(g-f)
Genética inversa-
proceso para determinar el fenotipo (o sea la función)
con base en el conocimiento del genotipo
(f-g)
Mutagénesis in vitro
permite a los investigadores hacer cambios específicos muy pequeños en una secuencia de DNA
- RNA de interferencia
proceso en el que se degrada un mRNA específico por la presencia de un pequeño siRNA bicatenario cuya
secuencia está contenida dentro de la secuencia de mRNA
- Uso de anticuerpos
proteínas que se producen en los tejidos linfoides como respuesta a la presencia de materiales extraños, o antígenos.
