Batt - COLTIVAZIONI Flashcards
TERRENO
Terreno/mezzo di coltura deve essere:
+ Adatto a soddisfare esigenze metaboliche del batterio in esame.
+ STERILE come il contenitore che deve avere chiusure idonee a mantenere questa condizione.
Possono essere SOLIDI o LIQUIDI.
AGAR = materiale solidificante, POLISACCARIDE ACIDO estratto da alghe, viene sciolto (>80°) in un liquido (1-2% del terreno) per poi farlo raffreddare => gelifica (<45°).
Proprietà:
- NON tossico per batteri.
- Pochissimi batteri hanno esoenzimi per depolimerizzarlo (=> tornerebbe liquido).
- Conferisce solidità sufficiente a permettere manipolazioni.
- Conferisce un’umidità sufficiente a permettere duplicazione, ma non il movimento.
- Il suo reticolo tridimensionale consente libera circolazione nei nutrienti, ma non dei batteri (eccetto micoplasmi e fase L).
Batteri sopportano brevi esposizione a 50°, quindi possono mettere più batteri diversi distretti di un’unica soluzione di Agar 1-2% disciolta a 45-50°.
Idealmente potrei allestire terreni rispondenti perfettamente alle esigenze metaboliche di ogni batterio, in pratica per risparmiare si usano BRODI BATTERIOLOGICI contenenti varie sostanze e che permettono anche una > RISPONDENZA.
Il brodo può essere liquido o gelificato con agar e contiene:
+ 0,5% PEPTONI = prodotti dalla digestione carne.
+ 0,3% ESTRATTO di CARNE.
Tutti portati ad ISOTONICITà mediante aggiunta di NaCl e tamponi di fosfato.
In base alle esigenze al brodo posso aggiungere: sangue (arricchente e permettere di rilevare produzione tossine emolitiche), siero (arricchente ed elimina sostanze che potrebbero essere tossiche), liquido ascitico, estratto lievito…
Condizioni di incubazione
Temp = 36° -> batteri patogeni sono MESOFILI (temp ottimale di crescita 25-45°).
Controllo concentrazioni gas dell’aria:
- Aereazione forzata per colture liquide di AEROBI OBB.
- Eliminazione O2 per ANAEROBI OBB. (contenitori a tenuta stagna in cui sostituisco l’aria con GAS INERTE (AZOTO) o dove elimino O2 con reazioni chimiche).
CURVA di CRESCITA in terreno LIQUIDO
Misurando la quantità di batteri in un’unità di Vol, di un terreno liquido, a diversi intervalli di tempo posso ricavare un grafico che rispecchia CINETICA del PROCESSO REPLICATIVO.
Fasi del processo in colture NON SINCRONIZZATE:
1. LATENZA -> NO AUMENTO n° batteri. La sua durata è molto variabile e dipende dal tempo che i batteri ci impiegano a produrre enzimi per degradare macromolecole del terreno.
2. ACCELERAZIONE CRESCITA -> progressivo AUMENTO n° batteri.
3. ESPONENZIALE/LOGARITMICA (coltura giovane) -> quando TUTTI i batteri sono in grado di REPLICARE. N° batteri che replica -> 2^N di batteri che si forma.
4. DECELERAZIONE CRESCITA -> quando CALANO nutrienti + AUMENTANO scorie -> ARRESTO replicazione in un numero sempre maggiore di batteri.
5. STAZIONARIA (coltura vecchia) -> posso avere un modico aumento della massa totale, ma il N° batteri resta COSTANTE perchè solo pochi replicano e altri iniziano a morire.
6. MORTE/DECLINO -> N° batteri CALA.
Nelle colture SINCRONIZZATE ho una rappresentazione a GRADINI (ciascuno con altezza x2 rispetto al precedente) della fase LOGARITMICA perchè le divisioni avvengono nello stesso momento nell’intera popolazione.
NB. -> le popolazioni batteriche non sono vecchie/giovani di per sé, è l’INTERAZIONE BATTERIO-TERRENO che ne definisce questo stato.
Cresci batteri in TERRENI SOLIDI
Batteri in Agar crescono formano PATINE (ho un > n° batteri i cui centri di crescita sono confluiti in una sola massa) o COLONIE ISOLATE (< n° di batteri).
La forma del batterio, con una certa specificità, determinerà la forma della colonia.
Le colonie possono essere S (liscio) o R (rugoso).
Passaggio S -> R determinato dalla perdita di un componente superficiale (capsula, porzione est. LPS…) => R avrà ANTIGENI DIVERSI e potere patogeno inferiore.
Colonie mucose date da batteri con CAPSULA ABBONDANTE.
Il Vol dei batteri si aggira sul 1 micrometro^3 => per vederne una colonia devo avere 10^6-10^7 batteri.
Duplicazione richiede 10-60 min => mi occorrono 18-24h di incubazione.
Nei terreni liquidi i tempi si allungano, ma rimaniamo comunque <48h.
COLTURE CONTINUE
CHEMOSTATI -> sistemi di coltura in cui SOTTRAGGO terreno INVECCHIATO e AGGIUNGO terreno FRESCO.
Non ho fase logaritmica perchè sottraendo terreno vecchio allontano parte della popolazione batterica.
=> N° e MASSA batteri = COSTANTE.
COLTURE ISOLANTI
In natura raramente ho specie microbiche isolate.
Devo quidni ottenere una COLTURA PURA dal materiale di origine.
Posso utilizzare terreni solidi dove inoculo singoli batteri ad una distanza tale per cui le colonie restano separate e da cui preleverò batteri da cui otterrò le colonie pure.
COLTURA MANTENIMENTO
Tecniche per mantenere colture in laboratorio.
+ Temp inferiore a quelle ottimali DOPO il raggiungimento della fase STAZIONARIA.
+ Posso essicare in liquidi ricchi di sostanze proteiche e liofilizzare.
I batteri sporigeni sono autonomi nell’autoconservazione.
