ARNs Régulateurs Flashcards
Qui propose le modèle pour étudier les détails mécanistiques de la régulation génique ?
François Jacob et Jaques Monod : L’expression d’un gène peut être contrôlée par le produit d’un autre. Il ne pouvait dire si le répresseur était une protéine ou ARN. Il pensait ARN mais c’est réellement une protéine.
ARNs régulateurs agissent sur ?
La transcription et la traduction.
ARN court qui régule la transcription chez les procaryotes ? Comment ?
ARN 6S
Il se lit à sigma70 de la polymérase et réduit transcription à nombreux promoteurs contrôlés par sigma70.
ARN 6S est présente en quantité élevée durant quel phase ? Quelle est cette phase ?
Phase stationnaire où il produit un facteur alternatif sigma(S).
Croissance stoppée : le nombre de bactéries qui naissent ≈ le nombre qui meurent.
Pourquoi ? Les nutriments s’épuisent, les déchets s’accumulent.
Les bactéries activent des gènes de survie, de stress et changent de métabolisme.
C’est ici que l’ARN 6S entre en jeu pour aider à adapter l’expression génique
Mécanisme d’action de sigma(s) ?
Entre en compétition avec sigma70 pour liaison à la polymérase. Grâce à cette compétition : l’ARN 6S réduit l’activité des promoteurs dépendants de σ⁷⁰, ce qui favorise l’expression des gènes dépendants de σˢ, adaptés aux conditions de stress ou de limitation des ressources.
Autre groupe d’ARN court bactériens qui régule la traduction et la dégradation de l’ARNm ?
sARN (80 à 110 nucléotides)
Codés par des petits gènes
Rôle des sARN ?
S’apparient avec séquences complémentaires ARNm cibles et entrainent la dégradation et/ou l’inhibition de la traduction de l’ARNm.
Rôle de Hfq : Protéine bactérienne exercant le rôle de chaperone de l’ARN ?
Protéine chaperone : fonction est d’Assister d’autre protéines dans leur maturation en leur assurant un repliement tridimensionnel adéquat.
Se lie avec sARN avant leur appariement avec ARNm et augmente leur stabilité.
Exemple 1 : sARN RybB (81 nucléotides) ?
Il entraine la destruction de ses ARNm cibles codent pour protéine de mis en réserve du fer. C’est RNaseE qui reconnaît hétéroduplexes sARN-ARNm comme substrat et le dégrade. RybB régule ainsi le niveau de fer (trop élevé = toxique pour la cellule).
Exemple 2 : gène rpoS ?
Code pour la sous-unité sigma S de l’ARN polymérase bactérienne.
Traduction ARN rpoS est réprimée par sARN OxyS qui bloque le RBS préalablement libre. La traduction est activée par sARN DsrA et RprA qui libère le RBS préalablement masqué par une tige-boucle.
(régulateurs qui agissent en trans)
Ribocommutateur ?
Les ribocommutateurs sont des éléments régulateurs d’ARN situés en cis (c’est-à-dire sur la même molécule d’ARN qu’ils régulent).
Ils contrôlent l’expression des gènes en réponse à des petites molécules (ligands), sans avoir besoin de protéines.
📍 Localisation :
Présents dans les régions 5’ non traduites (5’ UTR) des ARNm.
Rôle :
Les ribocommutateurs régulent l’expression au niveau de la transcription ou de la traduction, en modifiant la structure secondaire de l’ARN.
Ils sont composés de deux parties principales :
Aptamère : Domaine capable de lier spécifiquement une petite molécule (le ligand) avec plusieurs tiges-boucles.
Plateforme d’expression : Domaine qui réagit à la liaison du ligand en changeant de conformation
Mécanisme d’action ribocommutateur ?
Liaison du ligand à l’aptamère provoque un changement de conformation de l’ARN modifiant la structure secondaire de la plateforme d’expression = altère la terminaison de la transcription.
Exemple de ribocommutateur chez Bacilius subtilius avec gène impliqués dans l’utilisation de la méthionine (AA) ?
Le gène possèdent une région 5’ non traduite de 200 nucléotides contenant ribocommutateur de réponse au SAM.
En absence de SAM : tige boucle 2-3 permet la liaison de la polymérase à RBS.
En présence de SAM : induction de la tige boucle 1-2 et 3-4 = terminateur rho-indépendant de la transcription par la polymérase par processus d’atténuation = tige boucle 3-4 masque RBS et inhibe traduction.
Vrai ou Faux : Les ribocommutateurs sont contrôlés par différents ligands ?
VRAI
Ils répondent à une grande diversité de petites molécules, existent chez d’autre organismes et chez les eucaryotes, ils sont capable de contrôler l’épissage alternatif.
Comment fonctionne l’opéron trp ?
Contient des gènes responsables de la biosynthèse du tryptophane. Leur expression est contrôlée par la quantité cellulaire disponible de tryptophane, mesurée par le niveau d’ARNt(trp) dans la cellule. C’est un mécanisme d’atténuation provoqué par formation de structures secondaires d’ARN.
Mécanisme d’action de la région leader de l’opéron trp ?
Contrairement aux ribocommutateurs, qui sont régulés par liaison directe d’un ligand à l’ARN, la région leader de l’opéron trp utilise un mécanisme différent basé sur le couplage transcription-traduction, spécifique aux bactéries.
La région leader peut former plusieurs structures secondaires (épingle à cheveux), qui influencent :
1 . Soit la terminaison précoce de la transcription (atténuation).
2 . Soit la poursuite de la transcription jusqu’aux gènes codants.
Le signal ne vient pas d’un ligand, mais de l’état de traduction de trpL (gène qui code pour un peptide de 14 AA qui se trouve dans la région leader) :
1 . Tryptophane ABONDANT :
Le ribosome commence la traduction de trpL pendant que la transcription continue (transcription et traduction sont couplées chez les bactéries). Il ne bloque pas sur les codons trp (du peptide leader) car le tryptophane est disponible. Il couvre la région 2 de l’ARN pendant qu’elle est transcrite. Résultat : la région 3 s’apparie avec 4 → formation d’une structure de terminaison. La transcription s’arrête avant les gènes structuraux → pas besoin de produire encore plus de tryptophane.
- Tryptophane FAIBLE :
Le ribosome commence la traduction, mais stalle sur les codons trp car il manque de tryptophane. Il bloque sur la région 1, ce qui laisse les régions 2 et 3 libres pour s’apparier. Résultat : formation d’une structure anti-terminateur (2-3). L’ARN polymérase continue la transcription des gènes trp → la bactérie peut produire du tryptophane.
Qu’est-ce que l’interférence à l’ARN (ARNi) ?
Processus d’extinction d’expression de gènes par ARN courts (21-23 nucléotides) par 3 mécanismes : inhibition de la traduction de ARNm, dégradation de l’ARNm ou modifications de chromatine qui entraine répression de transcription.
3 types d’ARN courts qui participent à ARNi ?
- siSRN : ARNs courts interférents
Produits artificiellement ou synthétisés in vivo à partir de précurseurs.
2 . shSRN : ARN ‘courte tige boucle’ produits artificiellement.
3 . miARN : micros ARNs dérivés d’ARN encodés par des gènes codant ou non pour des protéines (possèdent leur propre promoteur).
Comment sont formé les siSRN, shSRN et miARN ?
Formés à partir de molécules d’ARN plus longues par une enzyme à activité RNaseIII : Dicer. Elle reconnaît et clive ARN longs double-brin ou strcutures formées par précurseurs de miARN.
Machinerie impliquée dans ARNi ?
Complexe RISC qui comprend ARNs courts et protéine Argonaute.
Mécanisme d’action de ARNi ?
ADN db entre dans le cellule et est clivé par Dicer en : siSRN, shSRN et miARN qui sont ensuite dénaturés pour engendrer un ARN guide (intégré et spécifique à RISC) et un ARN support (détruit). RISC mature est dirigé sur ses cibles par complémentarité de séquence entre ARN guide + cible. Si complémentarité est très forte, ARNm cible est dégradé. Cela indique à Argonaute qui possède sous-unité catalytique de cliver l’ARNm (exciseur).
Taille miARN ?
21 ou 22 nucléotides
Généré par 2 réactions successives de clivage à partir d’un ARN plus long transcrit du génome.
2 réaction de clivage qui mènent à la formation du miARN à partir du pri-ARN?
1ère réaction libère région ARN structurée en tige-boucle formant le pré-ARN.
2ème réaction génère le miARN à partir du pré-ARN.
*les deux côtés de la tige peuvent générer des miARN fonctionnels.
Les pré-miARN peuvent être ?
Dans la région codante, non codante, exonique ou intronique
Mécanisme détaillé des 2 réaction de clivage NUCLÉOLYTIQUE qui mènent à la formation du pré-miARN ?
1 . Gène transcrit par Pol II donne pri-miARN.
2 . Drosha réalise 2 clivages ppur couper la région pré-miARN (tige-boucle de 65 à 70 nucléotides) du pri-miARN. Drosha s’associe à Pasha et forment le complexe de maturation des miARN.
Que faut-il pour que Drosha puisse fonctionner ?
Régions flanquantes de tige-boucle doivent être peu structurées et former ARNsb en 5’ et 3’ de tige-boucle.
Où clive Drosha ?
Entre les parties inférieures (11 bp) et supérieures (22 bp) de la tige, ce qui génère pré-miARN composé de la région supérieure de la tige-boucle. Elle le clive en produisant extrémité’ sortante de 2 nucléotides ***Pour Dicer.
Comment le pré-miARN libéré par Drosha est transporté au noyau ?
Par protéine de transport exportin-5 où se produit la deuxième réaction de clivage par Dicer.
3 composantes de Dicer ?
2 domaines RNase III
1 domaine de liaison à l’ARNdb appelé PAZ
Structure de Dicer ressemble à ?
Hachette
Où est situé le domaine PAZ dans Dicer ?
Domaine PAZ situé à la base du manche et forme une poche de liaison pour l’extrémité 3’ de ARNdb.
Le manche de Dicer est formé de ?
Domaine intermédiaire contenant surface liaison chargée + pour ARN.
Le lame de Dicer contient ?
Domaines RNase agencés en dimères symétriques. Chaque domaine RNase porte site actif afin de cliver chaque brin ARNdb.
Rôle Dicer ?
Cliver tout pré-miARNdb en 2 fragments d’une longueur de 22 nucléotides.
Forme active du miARN ?
ARNsb (ARN guide) incorporé dans complexe RISC.
Que permet à l’ARN cible d’éteindre l’expression gène cible ?
Appariement cible de ARN guide.
Comment est généré le complexe RISC actif ?
ARNdb court est incorporé dans RISC et dénaturé en ARN guide + ARN support. Risque mature contient l’ARN guide et peut reconnaître et exciser ARN cible.
Structure/mécanisme de la protéine Argonaute ?
Domaine PAZ qui recconaît spécifiquement extrémité 3’ de l’ARN guide (apparié à l’ARN cible). Clivage se produit au milieu de la région d’appariement entre le 10ème et 11ème nucléotide.
Que se passe-t-il à la fin des années 1980 en lien avec les ARN courts régulateurs eucaryotes ?
Richard Jorgensen tente de produire des pétunias à fleur + violettes, mais le contraire se produit. Il découvre que + expression transgène était forte, plus l’expression de la couleur violette diminuait. ARN sens = même effet que ARN antisens.
Les travaux de Andrew Fire et Craig Mello explique que ?
Ce n’est ni l’ARN sens ni antisens qui inhibe l’expression des gènes mais l’ARNdb résultant de l’appariement des deux. ARNdb se révèle très efficace pour éteindre un gène.
1999 ?
Démontre que les siSRN dirigent le complexe RISC sur ARNm cibles.
2001 ?
Dicer est indentifiée.
2005 ?
Argonaute est identifiée.
1993 ?
Premier miARN et sa première cible est décrite par Ambros et Ruvkin.
Comment les siSRN peuvent réprimer l’expression des gènes au niveau de la transcription ?
Par des modifications de la chromatine/des histones aux promoteurs de gènes cibles.
Extinction centromérique chez la levure S. pombe ?
Chaque centromère possède une région centrale unique flanquée de répétitions communes à tous les centromères. Ces répétitions contribuent à la formation de l’hétérochromatine.
Que portent les histones de l’hétérochromatine ?
Marque de répréssion :
Faible niveaux d’acétylation et niveau élevé de méthylation de lysine 9 de H3 (favorisent la fermeture de la chromatine).
Une perte de la fonctionnalité de la machinerie ARNi (Drosha, Dicer, Argonaute …) entraine quoi ?
Perte de méthylation de l’histone H3K9 et une perte de la répréssion transcriptionnelle au niveau des centromères. Montre que la machinerie ARNi peut aussi réprimer la transcription.
Implication de la machinerie ARNi dans le contrôle transcriptionnel : Cas des répétitions centromériques ?
Au niveau des centromères, des répétitions sont transcrites sur les 2 brins par ARN Pol II. Cela produit des transcrit complémentaires qui peuvent s’apparier pour former ARNdb qui sont à leur tour transformés en siARN par la machinerie ARNi. Ces siARN dirigent RITS (complexe semblable à RISC).
Mécanisme du recrutement de RITS et l’extinction des centromères ?
ARNdb = substrat pour Dicer qui produit des siARNs. Ceux-ci sont chargés dans RITS contenant Argonaute (et Chpl et Tas3). Les siARNs sont alors recrutés par complémentarité au centromère. Complexe recrute Clr4 et Swi6 qui modifient localement les nucléosomes en ajoutant des marqueurs d’extinction : méthylation qui compactent encore plus la chromatine. Chp1 et Swi6 contiennent des chromodomaines (méthyles) qui lient les nucléosomes méthylés et stabilise la liaison du RITS à la chromatine.
Problème femme XX ?
Chaque gène du chromosome X devrait être 2X exprimé chez la femme que chez le mâle.
Problème femme XX solution ?
Phénomène de compensation du dosage qui permet d’éviter ce problème en inactivant un des 2 chromosomes X chez la femelle. Aucun gène du chromosome Xi peut être exprimé.
Quand se fait l’inactivation de Xi ?
Stade embryonnaire 32 ou 64 cellules. Choix du chromosome X à inactiver se fait au hasard dans chaque cellule. Conséquence : femelles mosaïque - certaines cellules expriment copie du père et l’autre de la mère.
Cas du chat calico (noire et orange) ?
Un gène du chromosome X détermine couleur orange ou noire de la fourrure. Chattes hétérozygotes pour ce gènes ont différentes zones de fourrure noire ou orange qui révèlent régions de cellules inactivées pour l’une ou l’autre des allèles. Explique pourquoi tous les chats calico sont femelles.
ARN Xist ?
ARN régulateur qui inactive un seul chromosome X chez les femelles mammifères (codé dans le locus Xic). Il est polyadénylé et épissé mais ne code pour aucune protéine.
ARN Xist mécanisme ?
Couvre progressivement tout le chromosome Xi à partir duquel il est activé.
Régions importantes pour la fonction de Xist ?
A : Région conservée qui porte 9 séquences répétées, qui forme de longues tiges boucles. Elle recrute Suz12 : appartient au complexe de répression PRC2 qui pourrait être impliqué dans le “silencing” de la chromatine.
C : Partie de l’ARN Xist qui interagit avec la chromatine du chromosome Xi.
Mécanisme de Xist ?
N’induit pas l’extinction des gènes mais recrute d’autre facteurs qui modifient et condensent la chromatine et méthyle peut-être l’ADN. Histones sur Xi sont désacétylées par rapport au reste du génome = répression génique car chromatine condensée. Cela assure la transmission de l’inactivation de Xi aux cellules filles.
Tsix ?
ARN régulateur codé par le locus Xic sur le brin opposé (à Xist) et qui chevauche le gène Xist.
Tsix mécanisme ?
Régulateur négatif de l’action de Xist. Si Tsix est muté sur un chromosome, ce chromosome sera choisi pour l’inactivation. L’équilibre de Xist et Tsix dans chaque cellule dicte le choix du chromosome X à inactiver.
