A. Méthodes Flashcards
Quelles sont les 2 sources de matériel cellulaire?
Quels sont leurs avantages et inconvénients?
- Le tissu animal (foie, coeur, muscle, cerveau)
Avantage:
- permet d’obtenir une grande quantité de matériel pour les études biochimique
Inconvénients:
- difficile à manipuler
- long avant que les échantillons soient prêts (naissance, devenir adulte)
- coût élevé
- éthique empêche l’avancement - Cellules en culture (primaires, immortalisées, cancéreuses/transformées)
Avantages:
- facile à manipuler et visualiser
- liberté de manipulation (on peut faire ce qu’on veut avec)
- poussent très vite
Inconvénients:
- pas toujours facile à faire pousser (pas dans leur environnement normal donc activités pas régulés par les autres cellules)
- matériel limité
- il faut souvent tester les traitements sur animal, pas sur cellules
Quelles sont les différences entre les cellules primaires, immortalisées et transformées?
Quels sont leurs avantages et inconvénients?
Cellules primaires:
- prélevées directement du tissu de l’animal
- nombre de divisions cellulaires limitées (30-50)
(pas faites pour se diviser infiniment, surtout en dehors de son environnement)
- les plus près des cellules à l’intérieur de l’organisme
- les plus dures avec qui travailler
Cellules immortalisées:
- ont acquit la capacité à se diviser indéfiniment (donc “anormales”)
- spontanées ou suite à l’introduction d’un gène dérégulant le cycle cellulaire
- propriétés varient entre les cellules humaines et de souris
- ne forment pas de tumeurs
Cellules transformées/cancéreuses:
- se reproduisent indéfiniment (donc immortalisées)
- mutations oncogéniques (cancer)
- forment des tumeurs
- très faciles à utiliser
- peuvent être prélevées directement
- Qu’est-ce qu’une protéine?
- Qu’est-ce qu’une enzyme?
- Qu’est-ce qu’un site actif?
- Qu’est-ce qu’un substrat?
- Qu’est-ce qu’un produit?
- Qu’est-ce qu’un ligand?
- Grosse molécule complexe composée d’acides aminés, qui constitue des matières organiques et des êtres vivants.
- Protéine qui agit comme catalyseur dans les changements chimiques.
- Partie du catalyseur (enzyme) où va se lier le substrat pour former le produit.
- Substance (molécules complexes, polymère, molécules simples…) sur laquelle agit une enzyme pour activer une réaction biochimique.
- Substance créée par l’assemblage de différents produits chimiques.
- Molécule/ion qui se lie à l’atome central d’un groupement d’atome (protéine) pour jouer un rôle fonctionnel.
Sur quoi sont basées les méthodes pour étudier les enzymes et organites?
Que doit-on faire avant de procéder à l’étude?
Les différentes méthodes sont basées sur les propriétés chimiques des macromolécules composant la cellule.
1. Préparer l’extrait cellulaire et isoler les organites
- utilisation de détergents (pour vider)
- centrifugation différentielle et gradients de sucrose
(pour briser la cellule)
2. Mesurer l’activité biochimique
- essais enzymatiques fluorométriques (fluorescence) et colorimétriques (coloration)
3. Chromatographie
- filtration sur gel (grosseur)
- échangeur d’ions (charge surface protéine)
- affinité
- SDS-PAGE et IEF
Quelles sont les limites physiques de la microscopie photonique? électronique?
Photonique: Limité par les propriétés de la lumière
- résolution max 0,2 um
- dépend de la longueur d’onde
- l’échantillon transparent (beaucoup de lumière)
Électronique: Limité par…
- processus de fixation et coloration créent artéfacts
- ne peut pas utiliser de cellules vivantes
Vrai ou faux: La microscopie optique (photonique) offre une meilleure résolution que la microscopie électronique.
FAUX.
La microscopie électronique (avec électrons) offre une meilleure résolution que la microscopie photonique (avec photons/lumière) avec une résolution de 200nm et 0,1 nm respectivement. Elle peut donc visualiser des structures autant au niveau des molécules que des cellules entières.
Quelles sont les différences entre le microscope électronique à transmission (TEM) à balayage (SEM)?
Transmission:
- préparation des échantillons
- nécessite fixation et coloration
- la section doit être mince (électrons ont une faible pénétrance dans les tissus)
- l’échantillon doit être déshydraté
Balayage:
- permet une image 3D de la surface de l’échantillon
- pour analyser la surface des cellules/organites et non les structures intracellulaires
- échantillon couvert de métaux lourds
- les électrons disposés sont collectés
(c’est un balayage des faisceaux et la détection de variation du nombre d’électron diffusés qu’on reconstitue la surface)
Quelles sont les méthodes pour visualiser les cellules par microscope photonique?
Colorants: on fait la coloration des échantillons avec des colorants tels:
- éosine (rouge): marque matériel cytoplasmique
- hématoxyline (gris): marque le noyau
- crésyl violet
Fluorescence: provient du fait que certaines molécules peuvent absorber de la lumière à une longueur d’onde spécifique et la réémettent à une longueur d’onde plus longue.
- permet de détecter des molécules spécifiques (ions, protéines) et de marquer des organelles
- chaque variété de molécules fluorescentes a un spectre d’absorption et d’émission spécifique et elles peuvent être utilisées en combinaison
Immunofluorescence
- utilise anticorps spécifiques pour une protéine cellulaire
- visualisation du complexe anticorps-protéine à l’aide d’un anticorps secondaire couplé à une molécule fluorescente
(le microscope à fluorescence est similaire au microscope optique, mais on place des filtres qui permettent de sélectionner les longueurs d’ondes d’absorption et d’émission appropriées)
Contraste de phase
- 2 ondes en phase produisent une luminosité forte
- 2 ondes pas en phase produisent une luminosité faible
Comment pouvons-nous s’assurer obtenir des images claires avec un microscope à fluorescence?
Si le spécimen est épais, il existe…
- la déconvolution, un traitement d’image à l’ordi d’un microscope optique
- microscope confocal
Quelles sont les limites de l’immunofluorescence?
Comment pouvons-nous y remédier?
- il faut des cellules FIXÉES (car on étudie un instant dans la vie des cellules)
- la fixation peut créer des artefacts
- on ne peut pas mesurer de paramètres (potentiel membranaire, mouvement des organites…)
Comment y remédier:
- molécules pouvant entrer dans des cellules VIVANTES et fluorescentes
Comment pouvons-nous remédier aux limites de l’immunofluorescence?
Certaines molécules peuvent entrer dans des cellules VIVANTES et fluorescentes. GFP
Green Fluorescent Protein
- protéine fluorescente isolée de l’Aequorea victoria (méduse bioluminescente)
- peut être fusionné avec d’autres protéines
- permet de visualiser les protéines dans des cellules vivantes
- différentes variantes (CFP, YFP) par mutagénèse
Quels organismes servent régulièrement de modèles de recherche?
- Levure (saccharomyces cerevisiae)
unicellulaire, simple génétiquement - C. elegans (vers)
environ 900 cellules
pour les études de mort cellulaire programmée - Drosophiles
vertébrés
se reproduisent facilement, utile pour études génétique
yeux et ailes facilement utilisable - Souris
recherches d’apprentissages moteurs
recherches dépression, anxiété - Arabidopsis
équivalent de la souris chez les plantes
Quelle est l’utilité de la déconvolution et de la microscopie confocale?
Déconvolution: permet d’améliorer la résolution et le bruit des images en microscopie de fluorescence
Microscopie confocale: système pour lequel l’illumination et la détection sont limités à un même volume de taille réduite. L’image confocale (ou coupe optique) est ensuite obtenue par le déplacement de ce point de focalisation de la lumière d’excitation dans les trois dimensions de l’échantillon XYZ
