4. Recombinaison homologue Flashcards
Quelles sont les trois grandes catégories de recombinaison génétique?
- Recombinaison homologue ou générale
- Recombinaison à des sites spécifiques
- Recombinaison illégitime
La recombinaison homologue permet l’échange de quoi?
Le matériel génétique entre deux molécules d’ADN homologues
End product de recombination homologue
Produit des séquences mixtes, dérivées partiellement d’un parent et partiellement de l’autre parent
Définition de recombinaison homologue
Série d’interactions entre 2 séquences d’ADN largement homologues présentes sur 2 différentes molécules ou sur 1 même molécule, qui produit des séquences mixtes dérivées partiellement d’un parent et partiellement de l’autre parent
La recombinaison à des sites spécifiques représente quoi?
Un mécanisme spécialisé dans lequel la recombinaison se produit à des sites spécifiques sur le chromosome, au moyen de très courtes régions homologues entre le donneur et la cible
La recombinaison illégitime permet quoi?
La recombinaison entre deux molécules complètement différentes, qui ne montrent aucune homologie de séquence
Quelle est l’importance de la recombinaison? (5)
- Permet le mélange des gènes lors de la méiose
- Le réarrangement des gènes
- L’activation de gènes lors du développement
- L’intégration des virus et des transposons
- La réparation de l’ADN, etc.
Caractéristiques de recombinaison homologue (2)
- Précision (pas de gain, pas de perte de nucléotides)
- Efficacité
Étude de deux aspects de la recombinaison homologue (2)
- Changements structuraux dans les molécules d’ADN
- Enzymes de la recombinaison
Voies de recombinaison (3)
- recBCD
- recE
- recF
Qu’est ce que le modèle de Holliday?
Modèle classique de recombinaison homologue
Mécanisme du modèle de Holliday (les 3 premières étapes)
- Les brins correspondants de deux molécules double-brins homologues s’alignent, puis sont coupés
- Les extrémités libres des brins coupés se croisent pour s’associer avec l’autre extrémité libre des brins
- Les brins d’ADN sont alors liés de façon covalente et le point de croisement (structure de Holliday) peut alors se déplacer dans l’une ou l’autre direction (migration)
Structure de Holliday peut être résolue pour générer deux types de recombinants dans des proportions équivalentes (les deux dernières étapes)
- La coupure des brins qui n’ont pas été impliqués dans la recombinaison génère un ADN dont les extrémités ont été échangées
- La coupure des brins qui sont impliqués dans la recombinaison provoque l’échange d’un segment simple-brin homologue
Étapes générales du modèle de Holliday (3)
- Formation de la structure de Holliday
- Déplacement de la structure de Holliday et échange des brins
- Résolution de la structure de Holliday
Est-ce que la recombinaison homologue génère des régions d’hétéroduplexes et mésappariements (DNA mismatch pair)
Oui
Évidences génétiques du modèle de Holliday (4)
- Après la méiose, les 4 chromosomes haploides sont complets
- La recombinaison est réciproque
- Des régions hétérologues sont formées
- À la même fréquence, on observe les « morceaux » et les
« échanges »
Évidences physiques du modèle de Holliday (3)
- Observation de la forme « chi »
- Le point de crossing-over est visible
- Les structures « chi » ne sont retrouvées que dans les bactéries RecA+
Preuve expérimentale du modèle de Holliday : Formation de co-intégrat (3)
Deux génomes circulaires homologues peuvent se recombiner
1. D’après le modèle de Holliday, une coupure simple brin est effectuée dans les 2 génomes
2. Les brins coupés envahissent l’autre génome et une structure d’Holliday est formée
3. La résolution de cette structure génère un co-intégrat si les deux brins non-impliqués dans la recombinaison sont clivés et deux cercles recombinants si les brins impliqués dans la recombinaison sont clivées
Le modèle de Holliday est-il parfaitement conforme à certaines observations?
Non. Telles que la présence de boucle en D et la formation non-réciproques
Qu’est-ce que le modèle de Meselson-Radding?
- Modèle alternatif du modèle de Holliday
- Modèle de recombinaison qui est couplée à la réplication de l’ADN
Mécanisme du modèle de Meselson-Radding (6)
- Processus de recombinaison initiée par une coupure simple brin dans un seul des brins d’ADN
- La césure génère une extrémité 3’-OH qui sert d’amorce à la synthèse de nouvel ADN en utilisant le brin complémentaire comme matrice
- L’extrémité du brin déplacée est libre et peut envahir l’autre duplex d’ADN, se pairer au brin complémentaire et ainsi provoquer le déplacement du brin homologue, créant la boucle D
- L’ADN de la boucle D est ensuite dégradé (ceci crée une extrémité qui permet sa liaison au brin qui se réplique. Ceci crée la structure de Holliday)
- La structure de Holliday migre
- La structure de Holliday est ensuite résolue par la coupure des brins impliqués ou non-impliqués dans la recombinaison
Qu’est ce qui a mené à la conduite du modèle du bris double-brin?
Recherches sur la levure qui entraient qu’un ADN portant une délétion pouvait se recombiner et être réparé durant le processus, ce qui ne pouvaient pas être expliquées par les deux autres modèles
Modèle du bris double-brin
La recombinaison est initiée par une coupure double-brin dans une des molécules d’ADN
La coupure double-brin est élargit par quels enzymes?
Exonucléases
Comment la boucle D est-elle créée dans le modèle du bris double-brin?
L’extrémité 3’-OH d’un des brins envahira l’autre duplex d’ADN
Comment la réplication de l’ADN permettra de réparer et de compléter la région manquante?
La réplication de l’ADN et l’élargissement de la boucle D, permet à celle-ci de se pairer à l’autre extrémité du duplex
Où débute la structure de Holliday?
Au site d’initiation de la recombinaison
Quels sont les deux processus dans lesquels la recombinaison implique la réplication de l’ADN dans les deux autres modèles?
- La région générée lors de la réplication de l’ADN montre une recombinaison non-réciproque puisqu’un des brins est perdu et remplacé par réplication
- Après la formation de la structure de Holliday, il y a migration de la structure sur des distances plus ou moins grandes. Ce déplacement génère une région dans laquelle la recombinaison est réciproque puisqu’elle est causée par un déplacement de brins existants
Importances de recombinaison homologue chez les procaryotes (2)
- Nécessaire pour la réparation des cassures bicaténaires de l’ADN
- Le redémarrage des fourches de réplication bloquées et la recombinaison de l’ADN chromosomique avec de l’ADN qui entre dans les cellules lors de l’infection par un bactériophage ou lors de la conjugaison
3 étapes de la recombinaison homologue chez les procaryotes
- Initiation (recBDC, topoisoméase, recA)
- Migration (ruvAB)
- Résolution (ruvC)
La recombinaison homologue chez les procaryotes est initiée par quoi?
Complexes enzymatiques (ex. recBCD) qui créent des régions d’ADNsb
Qu’est-ce que fait la protéine recA (recombinaison homologue chez les procaryotes)?
Reconnait ces sites et sert alors de matrice pour pairer les chromosomes et permettre l’échange des brins par la formation de la structure de Holliday.
La jonction de Holliday est reconnue par quelles protéines (recombinaison homologue chez les procaryotes)?
Protéines ruvA et ruvB qui permettent le déplacement rapide de la jonction et par ce fait l’allongement de la région recombinée
La jonction de Holliday peut être reconnue et clivée par quelle protéine (recombinaison homologue chez les procaryotes)?
ruvC, libérant ainsi les deux chromosomes
Les activités d’appariement et d’échange de brins de recA peuvent être observées comment?
in vitro en utilisant de simples substrats d’ADN
Les propriétés importantes des règles d’assimilation des brins sont: (3)
- La complémentarité des séquences entre les deux ADN partenaires
- Une région d’ADNsb sur au moins l’une des 2 molécules
- La présence d’une extrémité d’ADN dans la région de complémentarité
La recombinaison catalysée par recA d’un cercle simple brin et d’un ADN linéaire double brin peut se produire que si
La séquence à l’extrémité 3’ du duplex est complémentaire à la séquence du cercle
La recombinaison homologue chez la bactérie est initiée par quoi?
Le complexe protéique recBCD (hélicase, nucléase)
La recombinaison homologue chez la bactérie est effectuée par quoi?
La protéine recA (échange des brins)
La recombinaison homologue chez la bactérie est résolue par quoi?
Complexe protéique ruvABC (migration, résolution)
Le complexe recBCD est formé de quoi?
Des produits des gènes recB, recC et recD
Le complexe recBCD fait quoi?
- Initie la recombinaison en créant des bris dans l’ADN
- Le complexe “entre” dans l’ADN double-brin par une extrémité et migre de façon unidirectionnelle sur l’ADN
Qu’est-ce que fait le complexe enzymatique recBCD lors de sa migration?
- Le complexe enzymatique sépare les brins d’ADN localement pour produire des régions simple-brins
- Ces ADNsb sont dégradés par les activités nucléasiques de recBCD
recBCD cesse quoi à la rencontre d’une séquence chi (GCTGGTGG)?
- La dégradation du brin ayant une extrémité 3’
- Cet ADNsb est alors tapissé de la protéine recA (aidée par recBCD), ce qui initie la recombinaison
RecBCD a besoin de quoi pour amorcer le déroulement de l’ADN?
Une extrémité double brin libre
Extrémité double brin libre (3)
- Normalement absentes du chromosome bactérien circulaire
- Produites au cours des opérations de recombinaison provoquées par la transformation bactérienne, la conjugaison et la transduction induite par les phages
- Apparaissent lors de l’inactivation de fourches de réplication.
Fonctions de recBCD (3)
- Exonucléase ATP-dépendante
- Endonucléase à un site spécifique chi (5’ GCTGGTGG 3’) (ATP-dependante)
- Hélicase de l’ADN unidirectionnelle
Qu’est-ce que le recB?
Hélicase 3’ à 5’ qui possède également un domaine nucléolytique multifonctionnel
Qu’est-ce que le recD?
Hélicase 5’ à 3’
Role de recC
Reconnait les sites chi
Activité de recBCD
Coupe fréquemment chacun des brins pendant le déroulement de l’ADN
Mécanisme de recBCD
- Le brin 3’ est dirigé vers recB alors que le brin 5’ est dirigé vers recD
- Le brin 3’ monocaténaire émerge au niveau du site nucléolytique de recB. Il en résulte la digestion efficace et progressive de ce brin. Le brin 5’ passe également par le site nucléolytique de recB mais moins efficacement.
- recC reconnait la séquence chi et s’y fixe fortement (l’extrémité 3’ est piégée et ne peut plus avancer vers de site de dégradation qui empêche sa coupure et permet la dégradation facilitée du brin 5’)
- La queue 3’ monocaténaire sera recouverte de recA pour initier la recombinaison
Polarité de l’assemblage de recA (2)
- Les nouvelles sous-unités RecA rejoignent les sous-unités déjà présentes dans le filament et le font plus rapidement du côté 3’ de l’ADN que du côté 5’
- Par conséquent, les molécules avec extensions 3’ sont efficacement recouvertes de RecA alors que les molécules monocaténaires en 5’ ne servent pas de substrats pour l’assemblage du filament
Réaction d’échange des brins médiée par recA
- Les molécules d’ADN homologues sont appariées à l’intérieur de l’hélice formée de molécules de recA
- La molécule d’ADN recombinante forme une hélice à 3 brins. La rotation du filament recA autour de son axe force l’ADN duplex à s’embobiner avec le filament recA qui progresse de droite à gauche sur le schéma
- L’échange de 2 brins se fait grâce à la formation d’une structure de Holliday
Caractéristiques recA (3)
- Protéine centrale de la recombinaison homologue
- Membre d’une famille d’enzymes (protéines échangeurs des brins)
- Catalysent l’appariement des molécules homologues de l’ADN
Forme active de recA (3)
- Filament protéine-ADN
- La protéine recA reconnaît l’ADN simple-brin et s’y polymérise pour former un filament hélicoïdal dans lequel les réactions d’association et de recombinaison de l’ADN se produiront
- La protéine recA permet d’abord le déplacement des brins pour permettre l’appariement des régions homologues, puis l’ouverture de l’ADN double-brin et l’échange des brins homologues
Formation du filament (5)
- Les sous-unités de recA lient l’ADN de façon coopérative
- La liaison et l’assemblage de recA sont beaucoup plus rapides avec l’ADNsb qu’avec l’ADNdb, ce qui explique la nécessité de régions monocaténaires dans les substrats soumis à un échange de brins
- Le filament croît par l’addition de sous-unités recA dans le sens 5’ à 3’ de telle sorte que l’extrémité 3’ du brin d’ADNsb est celle qui est le plus efficacement recouverte de recA
- L’échange des brins est uniquement initié lorsqu’une des deux molécules d’ADN a une extrémité 3’-OH libre
- L’utilisation de cercles et de molécules linéaires homologues pour étudier la recombinaison a permis de montrer que la recombinaison est initiée par une extrémité 3’-OH libre et qu’elle ne tolère pas les régions non-homologues
Combien de conformations de recA existe?
2
Quelles sont les deux conformations de RecA?
Haute et basse affinité pour l’ADN
Haute affinité recA (5)
- Besoin d’ATP
- 18 nt/tour
- 19° rotation
- 5.1Å entre les nucléotides
- 1 recA/3 nt
Basse affinité recA (4)
- Pas besoin d’ATP
- 30 nt/tour
- 34° rotation
- 3.4Å
Modifications de l’ADN suite à la liaison à recA (3)
- Structure ADN dans le filament recA est fortement étirée par rapport à celle de l’ADNsb non recouvert ou à celle de l’hélice B
- Distance entre 2 bases est de 0.5 nm au lieu de 0.34 nm
- Longueur ADN est multipliée par environ 1.5
Où prend place la recherche de séquences d’ADN homologues et les échanges de brins?
Dans le filament
Cycle d’interaction entre recA et l’ADN (5)
- Une fois le premier brin d’ADNsb fixé dans la crevasse le long du filament, la protéine recA peut fixer une deuxième molécule d’ADN double-brin nu
- L’ADN se fixe du côté du sillon mineur, par sa structure phosphodiester
- Le sillon majeur est donc libre de réagir avec un autre ADN
- L’échange des brins permet la formation de la structure de Holliday
- Suite à l’hydrolyse de l’ATP, les molécules recA sont libérées et libres de se réassocier à de l’ADNsb
Combien de brins d’ADN peut contenir le filament recA?
1, 2, 3 ou 4 (1 et 3 sont plus populaires)
Deux sites distincts de liaison à l’ADN de recA
- Site primaire qui fixe l’ADNsb
- Site secondaire qui peut être occupé par l’ADNdb
Quand est-ce que recA catalyse la formation d’un complexe stable entre les deux molécules d’ADN?
Une fois qu’une région de complémentarité de bases est identifiée
Formation de molécule de jonction
Composée de recA et de 3 brins d’ADN, et contient généralement plusieurs centaines de paires de bases d’ADN hybride. C’est dans cette molécule qu’a lieu l’échange des brins.
Formation des triples-brins (2)
- La molécule de jonction contient recA et 3 brins d’ADN qui forment une triple hélice
- En plus des liaisons hydrogènes normalement retrouvées pour la liaison des paires de bases G:C et A:T, des liaisons hydrogènes supplémentaires permettent la liaison d’une troisième base et la formation stable d’une triple hélice
Rôle de l’activité ATPasique de la protéine recA: IN VIVO
Les mutants ATP- montrent le phénotype recA-
Rôle de l’activité ATPasique de la protéine recA: IN VITRO
- L’échange des brins et une migration limitée sont possibles
- Cependant:
- une migration longue est rare
- l’échange entre 4 brins est impossible
- la migration ne passe pas les régions hétérologues
Protéines ruvABC
Effectuent la résolution de la recombinaison
Fonctions ruvA (2)
- Nécessaire pour reconnaître et fixer la structure de Holliday
- Permet le positionnement de ruvB sur cette structure
Fonction ruvB (1)
Permet la migration de la jonction de Holliday
Fonctions ruvC (2)
- Nucléase qui coupe l’ADN recombiné
- Libère ainsi les deux duplex d’ADN
Recombinaison homologue chez les procaryotes (3)
- Réparation des cassures bicaténaires de l’ADN
- Redémarrage des fourches de réplication bloquées
- Recombinaison de l’ADN chromosomique avec de l’ADN qui entre dans les cellules lors de l’infection par un bactériophage ou lors de la conjugaison
Recombinaison homologue chez les eucaryotes (3)
- Réparer de l’ADN (cassures bicaténaires)
- Débloquer des fourches de réplication bloquées
- Rôles supplémentaires importants durant la méiose
Quels sont les rôles supplémentaires de la recombinaison homologue importants durant la méiose (2)
- Obligatoire pour aligner correctement les chromosomes homologues et maintenir l’intégrité du génome
- Redistribue également les gènes entre les chromosomes ce qui assure une variation des ensembles de gènes transmis à la génération suivante
Recombinaison homologue chez les eucaryotes pendant la phase S (5)
- Chromosomes d’une cellule (2N) sont répliqués pour donner un contenu total en ADN de 4N
- Les produits de la réplication, les chromatides sœurs, restent associés
- Lors de la première division nucléaire de la méiose, les chromosomes homologues dupliqués doivent s’apparier et s’aligner au centre de la cellule par recombinaison homologue
- La recombinaison doit être exécutée avant la première division nucléaire pour permettre aux chromosomes de s’aligner et de se séparer
- La recombinaison méiotique conduit fréquemment à des crossing-over entre gènes appartenant aux deux chromosomes homologues parentaux
Le programme de développement nécessaire à l’exécution de la méiose par les cellules implique l’expression de plusieurs gènes avec quelles protéines?
spo11, srx, dmc1 et plusieurs autres protéines sont retrouvées dans les complexes protéines-ADN qui forment les foyers de recombinaison
spo11 (2)
- Code pour une protéine qui introduit des coupures double-brin dans l’ADN chromosomique pour initier la recombinaison
- Les coupures ont lieu exactement au moment où les chromosomes homologues commencent à s’apparie
mrx (3)
- Complexe enzymatique est une ADN nucléase multimérique
- Reconnait les sites de coupures par spo11 et les réaménage en régions monocaténaires nécessaires à l’assemblage des protéines de type recA
- Comme il dégrade un brin d’ADN à partir des extrémités 5’, ceci engendre de longs segments d’ADNsb terminés par une extrémité 3’
dmc1 (3)
- Exprimé que dans les cellules qui entrent en méiose
- C’est un homologue de recA
- Rad51 est une autre protéine homologue à recA mais elle est exprimée aussi bien dans les cellules en division mitotique que celles en division méiotique
La recombinaison méiotique est initiée par quoi?
Une coupure bicaténaire d’un des chromosomes homologues par la protéine spo11
Le complexe Mrx est responsable de quoi?
Responsable de la résection des brins terminés par un 5’ au site de coupure, ce qui génère de l’ADNsb qui se termine par une extrémité 3’
Les protéines échangeuses de brin Dmc1 et Rad51 s’assemblent où?
Sur les queues d’ADNsb
