4. pred Flashcards
iz koje plijesni je izoliran penicilin
Penicillium notatum
koje bakterije proizvode streptomicin
Streptomyces
koji mikroorganizmi su glavni industrijski proizvođači sekundarnih metabolita
aktinomiceti
koje sekundarne metabolite najviše proizvode fungi
penicilinski antibiotici
statini
griseofulvin
imunosupresivi
navedi primjere sekundarnih metabolita
antibiotici
drugi lijekovi
(mikro)toksini
pesticidi
insekticidi
herbicidi
životinjski i biljni faktori rasta
kako se proizvode swkeundarni metaboliti
proizvode se karakterističnim biosintetskim putevima iz međuspojeva primarnog metabolizma
gdje se odvija citratni ciklus
u matriksu mitohondrija
rezistencija proizvođača na sekundarne metabolite
specifični transporteri
kompartmentacija (vezikule)
rezistentni enzimi
kako možemo provijeriti da li se neki gen eksprimira koji sudjeluje u sekundarnom metabolizmu
gen fuzioniramo sa genom za GFP i dobijemo protein koji je označen GFP-om, imamo stanični ekstrakt, 2D PAGE i imamo točkice, to je na razini proteina
a ako je na razini mRNA onda diferencijalno centrifugiramo i izoliramo mRNA
ako imamo dovoljno eksprimiranih proteina i dovoljno koncentracije kojom metodom specifično možemo popratiti sekundarni metabolizam
afinitetna kromatografija
ELISA
Streptomyces sp.
-gram-pozitivne bakterije koje formiraju micelij
-vrlo značajni proizvođači sekundarnih metabolita
-pri submerznom rastu biosinteza sekundarnih metabolita je karakteristična za stacionarnu fazu rasta i povezuje se sa limitacijom supstrata
-
koji je to unutarstanični signal kod Streptomyces sp.
visoko-fosforilirani guanozin (p)ppGpp
koja je poveznica između ppGpp i sinteze antibiotika
ppGpp promovira transkripciju gena koji kodiraju za proteine/enzime uključene u biosintezu antibiotika
ili je transkripcija ovih gena indirektna posljedica redukcije brzine rasta vrsta Streptomycens zbog inhibicije rRNA sinteze pomoću ppGpp
kako ppGpp točno utječe na transkripciju
veže se na RNA polimerazu te joj tako mijenja konformaciju i tako promijenjena RNA polimeraza “prepisuje” gene za sekundarni metabolizam, a ne gene za primarni metabolizam
koji je to vanstanični signal kod Streptomyces i zašto je važan
gama-butirolaktoni: A-faktor
potreban je za biosintezu streptomicina i morfološku diferencijaciju
poliketidi
-sekundarni metaboliti
-biosinteza je slična sintezi masnih kiselina
po čemu se biosinteza poliketida razlikuje od biosinteze masnih kiselina
-vrlo različiti acili preteče u sintezi poliketida
-djelomični ili potpuni izostanak reakcije redukcije beta-keto grupe nakon produženja lanca i zbog toga su poliketidi više oksidirani i mogu sudjelovati u više različitih reakcija od masnih kis. npr. reakcije kondenzacije
korizmati
-sekundarni metaboliti
-korizmička kiselina je “raskršće” u biosintezi aromatskih spojeva
-raskršće u primarnom metabolizmu je acetil-coA
sintetska biologija
sinteza cijelih setova gena sa odgovarajućim promotorima i njihov transfer u stanice pogodnog industrijskom mo
što je generacijsko vrijeme
to je vremenski period tijekom kojeg iz jedne stanice nastanu dvije stanice
koje su to razine regulacije metabolizma
- transkripcija
- translacija
- postranslacijske promjene proteina
koje su to posttranslacijske promjene proteina kod mehanizma regulacije metabolizma
- kompetitivna inhibicija
- alosterička regulacija (nekovalentna)
- kovalentne promjene
- kompartmentacija
- specifična rekombinacija
regulacija složenih metaboličkih puteva na razini aktivnosti enzima
-izoenzimi
-usklađena (kooperativna, multivalentna) regulacija povratnom spregom
-kumultativna regulacija
operon
-funkcionalna genetička jedinica koja sadrži regulacijske i strukturne gene
-osnovna transkripcijska jedinica iz koje se proizvodi jedna, u pravilu policistronksa mRNA sa pojedinačnog promotora
cistron
sturkturni gen koji kodira za protein
start kod
ATG
STOP kod
TAA/TAG/TGA
leader sekvenca
prepoznaje fosfolipidni dvosloj i odgovorna je da vodi protein kroz taj fosfolipidni dvosloj i poslije se može hidrolitički cijepati
inducibilni operon
represorski protein veže se na operaor i onda nema ekspresije gena
negativna kontrola inducibilnog operona
represorski protein veže se na operaor i onda nema ekspresije gena
kad je negativna kontrola postoji i induktor koji se veže na represor i on mu promijeni konformaciju, represor disocira sa DNA i onda dolazi do sinteze policistronske mRNA
represibilni operon
postoji inaktivni represor i tada dolazi do prepisivanja gena, ali ako postoji korepresor kompleks korepresor-represor se veže na operator i inhibira transkripciju gena, to je ujedno i negativna kontrola
pozitivna kontrola inducibilnog operona
postoji aktivator i ako je samo on prisutan nema ekspresije gena, potreban je i koaktivator da bi došlo do ekspresije tog gena
pozitivna kontrola represibilnog operona
postoji aktivator protein koji aktivira transkripciju, ali ako postoji i represor on inaktivira aktivator i ne dolazi do ekspresije
proizvodni mutanti
spontani ili inducirani mutanti koji su izgubili sposobnost regulacije određenog dijela metabolizma
-zbog mutacije “prekomjerno” proizvode određeni metabolit
vrste proizvodnih mutanata
regulacijski (ne-represibilni) mutanti
auksotrofni mutanti
regulon
grupa operona koju kontrolira zajednički regulacijski protein
-operoni koji čine regulon u pravilu su bez nekog reda razmješteni po genomu
glp-regulon
od koliko operona se sastoji glp-regulon i opiši svaki
sastoji se od 4 operona
operon 1- kodira za enzime za anaerobni metabolizam glicerol-fosfata
operon 2- kodira za enzime za aerobni metabolizam glicerol-fosfata
operon 3- kodira za peoteine/enzime koji su uključeni u trasnport i metabolizam glicerola
operon 4- kodira za enzime za transport glicerol-fosfata
modulon
grupa regulona i/ili operona u kojoj je svaki član grupe pod kontrolom zajedničkog globlnog proteina
crp modulon
crp modulon-od čega se sastoji i za koje proteine/enzime kodira
lac i sor operon
gal, glp, mal regulon
kodira za proteine/enzime katabolizma
kolika je koncentracija cAMP-a u stanici
1-10 mikromola
skoro cijeli katabolizam je pod regulacijom ove alarmonske molekule
šta je alarmon i koji su alarmoni za katabolizam, a koji za anabolizam
to je mala molekula koja signalizira stresno stanje pa tako djeluje kao globalni regulator
za katabolizam: cAMP
za anabolizam ppGpp i pppGpp
stimulon
velika grupa operona koji reagiraju na istu pojedinačnu pobudu, a da pri tome nisu regulirani djelovanjem zajedničkog regulacijskog proteina
primjer pobude: glad, toplinski šok, oštećena DNA, infekcija fagom
četiri uloga kinaze
fosforilacija ugljikohidrata u metaboličke svrhe
fosforilacija proteina u regulatorne svrhe
provođenje signala u uvjetima u okolini stanice
morfološko biokemijska diferencijacija stanica kao što je sporulacija
kod kataboličke represije izvorom ugljika za enterobakterije karakteristični su
brz rast na glukozi (“glukozni efekt”)
diauksijski rast na glukozi i još jednom izvoru ugljika
kada se javlja katabolička represija izvorom ugljika
kada katabolizam prevlada anabolizam
koje je osjetilo za kataboličku represiju izvorom ugljika
PTS
koji protein je globalni regulon kod prijelazne ili stalne represije i opiši šta se točno događa
prvo imamo PTS koji je osjetilo za KRIU i on prenosi informaciju preko IIAglc proteina do adenilat ciklaze i onda preko cAMP do crp modulona i on se pokreće
crp protein crp modulona je globalni regulator
geni lac operona i za šta kodiraju
lacZ beta galaktozidaza
lacY membranska permeaza
lacA galaktozid transacetilaza
koji je represor lac operona
LacI
koji je tip glikozidne veze u laktozi a koji u alolaktozi
laktoza 1,4
alolaktoza 1,6
šta je intercistronska regija
cistron je gen, a intercistrinska regija je prostor između dva gena
što sadrži intercistronska regija lac operona
-mjesto vezanja kompleksa cAMP-CRP koji je aktivator transkripcije
-operator za vezanje produkta lacI gena (represora)
-dva promotorska mjesta za vezanje RNA-polimeraze
ptomotor P2 kod lac operona
-odgovoran je za bazalnu, konstitutivnu ekspresiju strukturnih gena lac operona
-veže čvrsto RNA-polimerazu
-inicijacija transkripcije je jako slaba
-koncentracija beta-galaktozidaze i laktoza permeaze u stanici je vrlo mala
koja dva signala su potrebna za potpunu indukciju operona
-visoka koncentracija cAMP u stanici (“glad”)
-prisutnost laktoze u okolini stanice
koji su produkti hidrolize laktoze
glukoza i galaktoza
kako izazvati glad kod E.coli
u kemostatu limitacijom supstratom ili šaržno u stacionarnoj fazi
što je to trostana ravnoteža kod beta-galaktozidaze
beta-galaktozidaza izomerizira laktozu u alolaktozu i djelomično je hidrolizira u glukozu i galaktozu
znači trostana ravnoteža jer imamo laktozu, alolaktozu, D-galaktozu i D-glukozu
šta je ionduktor kod lac operona
alolaktoza
koji tip operona je lac operon
inducibilni
kako kompleks cAMP-CRP utječe na transkripciju
kompleks se veže na mjesto vezanja u intercistronskoj regiji i time reprimira transkipciju sa P2 i aktivira transkripciju sa P1
-na ovaj način se povećava afinitet vezanja RNA-pol na DNA
-istovremeno nse lakše pokreće i nastavlja elongacija mRNA
gdje represor kod lac operona onemogućava trasnkripciju
transkripciju sa P1, pa preostaje samo bazalna transkripcija sa P2
zašto nam treba puno kopija gena lac operona
jer imamo puno laktoze u stanici, treba je transportirati, mrtabolizirati i treba represoru onemogućiti da se veže na operatorsko mjesto
koja vrsta transporta je kada se transportira laktoza u e.coli
sekundarni transport i ovisan je o elektrokemijskom gradijentu pa u procesu trebamo podesiti pH
diauksijski rast prepričaj i skica
ima li kompleka cAMP-CRP kada je samo laktoza
NEMA
hoće li doći do transkripcije gena lac operona u destiliranoj vodi, opiši
ne i to je jedini slučaj
koja je razlika kod gram-poz bakterija kod KRIU
nemaju crp protein
cAMP se u citoplazmi nalazi u tragovima
nemaju proteina IIAglc
umjesto crp modulona djeluje ccpA
promotorske cre sekvence na koje djeluje CcpA protein
kako ćemo zaobići kataboličku represiju glukozom, a ima glukoze u stanici?
uvest ćemo mutaciju u EII onda nema trabnsporta i fosforilacije glukoze
tako mutantom na glukozi možemo proizvoditi inzulin
koji je represor kod gram poz, a koji kod gram neg bakterija
poz-CcpA
neg-LacI
koji su načini prilagodbe i preživljavanja bakterija u različitim uvjetima
re-modeliranje proteinskih kompleksa, prenošenje signala fosforilacijom i proteoliza
kako se aminokiseline uključuju u metabolizam ugljika i primjer
potrebno je deaminirati Ak
primjer je glutamin i alfa-ketoglutarat i tako se uključuje u citratni ciklus
kojom brzinom rade robosomi
maksimalnom, 16 AK po sekundi
šta se događa s e-coli kada je u siromašnim podlogama, a šta kada je u bogatim (generacijsko vrijeme i broj kromosoma)
u siromašnim generacijsko vrijeme je tri sata i ima oko 2000 ribosoma po stanici
u bogatoj generacijsko vrijeme je 20 min i ima oko 20 000 ribosoma po stanici
kako prebrojati robosome u stanici
uzgojimo na siromašnoj ili bogatoj podlozi, razbijemo stanice, diferencijalno centrifugiramo pa protočna cirometrija ili se ribosom označi GFP-om
kako uzgojiti mo u inimalnoj podlozi
šaržno pa ćemo staviti određenu konc koja nas zanima prvo u niskoj koncentraciji ili kontinuirano pa ćemo imati limitaciju tog supstrata
opiši šta se događa kod shift up i down eksperimenta
69 i 70 slajd
“stoga” kontrola ili “stogi” odziv
kompleksni odziv u kojem je uspostavljena regulacijska povezanost između
-brzine rasta stanica
-veličine stanica
-broja ribosoma u stanici
u kojim sve reakcijama sudjeluje (p)ppGpp
sudjeluje u regulaciji transkripcije, translacije, regulira sintezu rRNA i tRNA
kako je istražena sinteza ppGpp-a
u bakteriji e-coli u uvjetima stresa istražen je RelA/SpoT modulon
koju reakciju katalicira RelA
sintezu ppGpp-a iz GTP-a uz utrošak ATP-a
puno ime enzima Gpp
pppGpp-5’-fosfohidrolaza
puno ime enzima SpoT
(p)ppGpp-3’-pirofosfohidrolaza
puno ime enzima Ndk
nukleozid-5’-difosfat kinaza
kako se Ak mogu transportirati u stanicu
simportom sa H+ ionima
koja je uloga SpoT enzima kod situacije zakoćenja ribosoma
on može sintetizirati, ali i razgraditi ppGpp
odgovroan je za drugi krug sinteze pppGpp-a koji djeluje na pobudu izazvanu nedostatkom izvora C
koje su neke uočene promjene kod povećanja koncentracije ppGpp-a
-“zakočenje” brojnih ribosoma i prestanak sinteze proteina
-inhibicija aktivnosti RNA-pol vezanje ppGpp-a na beta podsjedinicu
-ne formiraju se nove replikacijske viljuške (prestanak sinteze DNA)
inhibicija transkripcije gena za stabilne RNA moleule (tRNA i rRNA)
-akumulacija nedovršenih peptida u stanici aktivira “stres-proteine” koji potiču proteolizu čime se kratkotrajno nadoknađuje manjak aminokiselina
-aktiviraju se biosintetski i katabolički operoni
50 integriranih metaboličkih blokova (modulona) u bakterijskoj stanici podijeljeno je u četiri klase
-moduloni uključeni u dobavu supstrata i energije
-moduloni uključeni u prilagodbu stresu
-moduloni uključeni u diferencijaciji stanica (sekundarni metabolizam, sporulacija)
-moduloni uključeni u agregaciju stanica i “kontakt” među stanicama (biofilmovi, dentalni plakovi, quorum sensing)
šta je vegetativni stanični ciklus
stanice svih mo povećavaju svoju masu, rastu i dijele se i tako mogu nastati dvije identične stanice kćeri, taj cjelokupni proces je vegetativni stanični ciklus
-povećanje mase spominjali smo kod shift-up pa je jako teško prepoznati da li se stanica prilagođava novonastalim uvijetima ili se ćeli dijeliti
šta se događa kod vegetativnog staničnog ciklusa kod prokariota
genetski materijal je udvostručen
novonastali kromosomi su separirani
stanica je podijeljena
koje su faze vegetativnog staničnog ciklusa, trajanje perioda faza
B, C, D
trajanje c id perioda ne ovisi o brzini rasta mo
trajanje b perioda se povećava sa generacijskim vremenom
formiranje spore je način
preživljavanja stanice u nepovoljnim uvjetima
širenje i kolonizacija različitih staništa(strujanje zraka, oborine, životinje)
kako započinje sporulacija i šta nastane
započinje asimetričnom diobom stanice
nastaje prespora (razvija se u endosporu) i stanica majka (lizira i tako otpušta endosporu)
pobude koje iniciraju sporulaciju nisu precizno definirane, a mogu biti
-iscrpljivane supstrata (“glad”); izvori N,C, smanjena koncentracija GTP-a
-određena gustoća stanica (quorum sensing)
malobrojne stanice određene vrste mo u uvjetima “gladi” ne sporuliraju
komunikacija vanstaničnim proteinskim faktorima-signalnim molekulama
-sinteza DNA
DNA potrebna za formiranje kromosoma stanice majke i kromosoma spore
inicijacija sporulacije kod B.subtilis
uključuje različite signale koji aktiviraju histin protein kinaze
zašto je teško istraživati pobude sporulacije
kada nemamo izvore ugljika imat ćemo malu brojnost stanica
morfološke karakteristike sporulacije opiši i skica
koliko gena postoji u fazi sporulacije i za koje proteine kodiraju
24 gena i kodiraju za signalne, regulacijske i strukturne proteine koji su aktivni u različitim fazama sporulacije
kako započinje inicijacija fosforilacije
fosforilacijskom kaskadom
nekoliko protein kinaza čini tkz. fosforelej sustav i kao posljedica fosforilacijske kaskade dolazi do segregacije sigma faktora, tj. sinteze 4 specifična sigma proteina
zašto je teško odrediti koncentraciju spojeva u sporama
spore su jako črvste pa ih je teško razbiti
također je malo spora i uz to mala je koncentracija tih spojeva u sporama čak i kada ih dodatno uzgojimo u stresnim uvjetima
puni nazin 3-PGA
3-fosfoglicerinska kiselina, visokoenergetski spoj
“pospanost” stanice
u stanici postoje aktivni enzimi i metabolički putevi da dođe do nasatjanja vegetativne stanice kada spora pređe u povoljne uvjete
nabroji sve fosforilacijske kaskade koje smo učili
PTS
neciklička i ciklička fotofosforilacija
inicijacija sporulacije
dvije uloge sigma faktora
transkripcija i inicijacija sporulacije
kako napraviti malu gustoću stanica
razrijediti u destiliranoj vodi ili minimalnoj podlozi i onda napravimo shift-down eksperiment
kako odrediti koncntraciju DNA
spektrofotometrijski na 260 nm, znači izoliramo DNA i odredimo optičku gustoću
koje su to pobude stacionarne faze
to su zapravo uvjeti u stacionarnoj fazi tijekom šaržnog uzgoja:
-ima malo ili ništa supstrata
-ima jako puno stanica
-ima puno proizvoda metabolizma i drugih proizvoda koje stanica proizvodi
-koncentracija kisika ako je mo aeroban je niska jer je koncentracija drugih sastojska podloge visoka i visoka je gustoća stanica
proteini phospho-relay puta
SpoOF
SpoOB
SpoOA
koji proteini su transmitteri signala, a kogi receiveri signala kod sporulacije
transmitter (Kin A i Comp)
receiver (SpoOA i ComA)
na koje gene SpoOA djeluje pozitivno, a na koje negativno
negativno djeluje na gen abrB koji kodira za AbrB represor vlastitog gena
pozitivno na gene koji kodiraju za sigma faktore F i E
koje sigma faktore ima stanica majka, a koje spora
majka: E i K
spora: F i G
što je potrebno za sintezu sigma K
potrebna je mjesno-specifična rekombinacija koju katalizira specifična rekombinaza
rekombinacijom nasatje gen koji kodira za prekursor i onda posttranslacijskim modifikacijama nastane sigma K
koje su faze klijanja spora
aktivacija
klijanje
sigma G provodi transkripciju kojih gena
gena za formiranje korteksa i gena za sazrijevanje spore
sigma K u čemu sudjeluje
sudjeluje u formiranju korteksa i motača spore kao i u sintezi proteina/enzima koji kataliziraju autolizu stanice i “oslobađanje” spore
što su fermentacijski procesi
podrazumjevaju anaerobne redoks reakcije u kojima se supstratnom fosforilacijom pridobiva ATP
-supstratna fosforilacija povezana je s oksidacijom supstrata
-tijekom oksidacije supstrata transport elektrona nije povezan s pridobivanjem energije
metabolizam ugljikohidrata (vrste fermentacije)
homolaktična fermentacija
heterolaktična fermentacija
fosfoketolazni put
metabolizam ugljikohidrata kod Bifidobacterium bifidum
zašto bakterije mliječne kiseline proizvode laktat
on može biti akceptor ili donor elektrona
zašto u uvijetima limitacije supstrata proizvodi acetil-coA, acetat i etanol
jer se kod acetata proizvede 1 ATP, a kod etanola reoksidira NADH i tako stanica pridobije malo energije u fazi limitacije supstratom
koje supstrate prepoznaje EII podjedinica za manozu kod transporta UH kod BMK
manoza
glukoza
fruktoza i neki analozi (2DG)
fruktoza koja se fosforilira nakon transporta permeazom i fruktoza koja se fosforilira tijekom PTS-a EII za fruktozu i EII za manozu
permeaza F-6-P
PTS EII fru F-1-P
EII man F-6-P
kojim vrstama transporta se transportira galaktoza
permeaza
EIIgal
permeaza koja je ovisna o gradijentu protona
kako se transportira laktat
simport sa H+ ionima
citrat/laktat antiport