2.pred Flashcards
vrste svjetlosne mikroskopije
izravna (transmisijska)
fazno-kontrastna
diferencijalno-kontrastna
tamnog polja
metode elektronske mikroskopije
diferencijalno bojanje
mikrotomski presjek
vrste elektronske mikroskopije
izravna elektronska mikroskopija (TEM)
skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM)
difrakcija X-zraka
što proučava
-proučava strukture makromolekula
-najvažnija metoda za karekterizaciju 3D strukture proteina i enzima
metode dobivanja ekstrakta stanice
ultrazvukom
osmotski šok
u tarionicima i kugličnim mlinovima
propuštanjem kroz mali otvor pod visokim tlakom
-uporaba ekstrakcijskog reagensa
vrste centrifugiranja
diferencijalno centrifugiranje
razdvajanje u gradijentu gustoće
razdvajanje na temelju gustoće plutanja
koje metode koristimo kada želimo odvojiti proteine
ionsko-izmjenjivačka kromatografija, gel-filtracija
koja metoda je dobra za razdvajanje oligosaharida
ionsko izmjenjivačka kromatografija
kojim metodama se razdvajaju proteini označeni tag-ovima
HPLC
FPLC (fast protein liquid chromatography)-kod većih koncentracija i volumena
vrste tag-ova
Strep
His
GST (glutation-S-transferaza) to je protein
Flag
kojom metodom možemo analizirati jako male koncentracije proteina
nanoLC
kako možemo detektirati ugljikohidratne podjedinice kojima su proteini glikozilirani i zašto
nanoLC
inače je jako teško detektirati jer uvijek postoji više podjedinica i postoje cijeli lanci, ali i zbog molekulske mase jer su ugljikohidrati slični po svojoj molekulskoj masi i svojstvu da primaju naboj
kojom metodom možemo odrediti koncentraciju AK i kako se priprema uzorak
plinska kromatografija
aminokiseline se izvrsno otapaju u vodi, ali nisu hlapljive zato ih je potrebno derivatizirati i prevesti u estere koji su hlapljivi
šta sve možemo razdvajati i analizirati plinskom kromatografijom i zašto koristimo GC
ugljikovodike, alkohole i aromate
daje informaciju o strukturi i koncentraciji spojeva
vrste gel elektroforeza
SDS-PAGE
LDS-PAGE
nativna PAGE
IEF
2D
kojom metodom možemo procijeniti masu određenih denaturiranih proteina
SDS-PAGE
šta možemo saznati kada usporedimo SDS-PAGE i nativne PAGE
u SDS-PAGE su proteini denaturirani pa tako procjenjujemo masu monomera, a u nativnoj proteini mogu biti dimeri, tetrameri i onda možemo usporediti koliko monomera ima u nativnom proteinu
FAD koje obojenje i na koliko nm
žuto na 340 nm
koji kofaktor imaju dehidrogenaze i na koliko nm
NADH na 340 nm
kako možemo detektirati točkastu mutaciju
ionsko-izmjenjivačka kromatografija
prvo stupnjevito eluriamo proteine, nakon toga uvedemo točkastu mjutaciju i vidimo da se protein ponaša kao npr. protein 1, uglavnom točkasto mutacijom promjenimo samo jednu ak i vidimo kakko se FAD drugačije smjestio u AM
cirkularni dikroizam šta je i zašto se koristi
-spektoskopska metoda koja otkriva informacije o kiralnosti molekule
-koristi se za identifikaciju kiralnih spojeva, njihovih konfiguracija, daje mogućnost predviđanaj sekundarnih struktura proteina i drugih bioloških makromolekula, moguće je pratiti procese vezanja liganada
kako se može pratiti aktivnost enzima
primjena mikrosenzora
to je važno jer u jako malim volumenima možemo potrošiti malo enzima, supstrata i napraviti analizu našeg enzima
za one proteine za koje kodiraju geni koji se slabo eksprimiraju
na kojem principu se baziraju mikrosenzori
smanjenje intenziteta fluorescencije (eng. quenching) kisikom
-kisik je poznat utišivač fluorescencije u smjesi, u reakciji se troši kisik
kapilarna elektrokromatografija
HPLC i kapilarna elektroforeza
za vrlo male koncentracije i dobijemo jako fine pikove
kako možemo detektirati protein koji je obilježen GFP-om
direktno mikroskopom ili detektorom detektirati kako se protein sintetizira i namata po intenzitetu fluorescencije, možemo pratiti i kako se taj protein kreće bilo da je sekrecijski protein (svj. prolazi kroz Golgijev aparat) ili se trasportira u neki organel unutar stanice kod eukariota
kako možemo pratiti interakciju dva proteina
sustav dva hibrida
fluorescentno obilježiti jedan protein npr. zelenim fluorescentnim proteinom, a drugi crvenom fluorescencijom
kako možemo pratiti hidrofobnost proteina
pomoću fluorescencijen
nabroji tri metoda u kojima trebamo električno polje
elektroforeza
kapilarna elektrokromatografija
?
tri metode koje trebaju pumpu
HPLC
GC
MS
nabroji neke primjene GFP-a
obilježavanje stanica i organela
marker kod fuzije
ekspresija gena
protein-protein međudjelovanje
lokalizacija proteina
koponente MS sustava
ulazak uzorka
ionizacija
analizator
detektor
spremanje i obrada podataka
ESI-puni naziv i ponovi postupak
ElectroSpray Ionization
29.str
IT-puni naziv i ponovi postupak
Ion Trap
31.str
što koristimo kada želimo karakterizirati proteine, peptide i druge molekule kod malih koncentracija
MS-IT
in silico modeli
set primarnih informacija koji se odnosi na određeni (mikro)organizam
-baza podataka načinjena od biokemijskih, genetičkih i drugih podataka čiji se međuodnos može opisati matematičkim jednadžbama
zašto stanice u kemostatu pratimo u eksponencijalnoj fazi
jer tada imamo puno stanica i ako želimo izolirati neki sastojak stanice imat ćemo ga u dovoljnoj koncentraciji
koja je glavna zakonitost kemostata
D=mi
D je brzina razrjeđenja
mi je specifična brzina rasta mo
protok na ulazu i na izlazu mora biti isti [L/h]
kako možemo popratiti biomasu u kemostatu
označiti fluorescencijom i tako pratiti
kada uzimamo uzorak za analizu u kemostatu
kada prođe 5 korisnih volumena
problemi vezani za uspostavljenje ustaljenig stanja u kemostatu
neidealno miješanje (koncentracijski gradijent)
rast biomase na stijenkama
koncentriranje stanica u pjeni
vrijeme obrade uzorka prije analize
kako su istraživači okarakterizirali metabolički put glikolize
mutacijama
prvo moramo znati gen koji kodira za određeni enzim i kada izbacimo taj gen glikoliza staje
kako se kontrolira metabolizam glukoze i šta to pokazuje
povratnom spregom
to pokazuje promjena koncentracije unutarstaničnih međuspojeva
kemostat in vivo-kakve su koncentracije G6P i GAP-a u periodu od 100 s
visoke su zbog regulacije glikolize i pentoza-P puta
koji međuspoj glikolize utječe na aktivnost piruvat kinaze
fruktoza-1,6-bisfosfat
zašto ne nastaje glikogen kada se glukoza transportira u stanicu nego se odvija glikoliza
jer je za taj proces potrebna visoka koncentracija ATP-a
NMR
nuklearna magnetska rezonancija
-in vivo NMR je neinvazivna metoda određivanja koncentracije metabolita u različitim odjeljcima stanice
koji se princim NMR metode
u magnetnom polju elektroni određenog atoma kruže u smjeru ovog polja; kruženjem elektrona nastaje drugo, suprotno magnetno polje oko jezgre atoma; gustoća elektrona oko jezgre ovisi o vrsti jezgre i vrsti veza kod određene molekule (npr. metanol)
primjena NMR
-NMR analiza 31P omogućava praćenje metabolizma ugljikohidrata jer se ovom metodom mogu razlikovati unutarstanični i vanstanični anorganski fosfat, zatim pirofosfat, ATP
-NMR analiza 13C zahtijeva korištenje spojeva bogatih na ovom izotopu; metaboličko inženjerstvo
zašto nam je korisno metaboličko inženjerstvo u proizvodnji
jer u jednom trenutku je potrebno usporiti rast biomase jer nam treba izvor ugljika, dušika za proizvodnju ciljanog proizvoda, plus ne želimo na kraju bioprocesa imati nekoliko tona biomase nego naravno više ciljanof proizvoda
što se dogodi kada se radi sa parnim izotopom u NMR-u
tada se spoj ne vidi na spektru
nabrojite tri metode kojima možemo pratiti konverziju molekula različitih metaboličkih puteva
NMR
primjena radioizotopa
fluorescencija
kakvi brojači postoje kod primjene radioizotopa
Geiger i scintilacijski brojači
zašto se primjenjuju radioizotopi
-stpnjevita ili udarna pobuda: određivanje redoslijeda reakcija u biokemijskim putevima
-praćenje ugradnje građevnih blokova u polimere
-lokalizacija određenih funkcijqa u stanici:autoradiografija, analiza frakcija stanica
-proučavanje transporta u stanicu
scintilacijsko brojanje
određivanje radioaktivnog raspada određene tvari, tj. određivanje količine radioaktivnosti u uzorku
-energija koja se oslobađa tijekom radioaktivnog raspada prevodi se u energiju koja se mjeri scintilacijskim brojačem
scintilacijski brojač-šta je i kakve izotope koristi
fotoćelija visoke rezolucije koja može detektirati alfa-četice, beta-čestice i gama i x zrake. te pozitrone, Comptonove i Angerove elektrone
-korissti parne izotope (14C, 32P) i po tome se razlikuje od NMR
šta su protutijela
to su proteini koje proizvode kralješnjaci kao obranu nakon infekcije
što sve mogu biti antigeni
proteini, DNA, RNA, polisaharidi, organeli, druga antitijela
kakva sve antitijela postoje
heteroklonska i monoklonska
-Heteroklonska antitijela su smjesa antitijela koja dolaze od različitih B-limfocita i prepoznaju različite epitope (dijelove antigena) na istom antigenu.
-Monoklonska antitijela su homogena populacija antitijela koja dolaze od jednog klona B-limfocita i prepoznaju jedan specifičan epitope na antigenu.
primarne stanice
stanice oslobođene od ostalog dijela tkiva uzgojene u prikladnim uvjetima, rastu i razmnožavaju se tek nekoliko generacija
besmrtne stanice
kontinuirane stanične linije, posebni izolati koji se razmnožavaju beskonačno
hibridoma
hibrid između primarnih stanica B limfocita i mutiranih - tumornih stanica B limfocita, besmrtne stanice sa značajkama primarnih stanica
zašto se primjenjuju antitijela i koje su to metode
jer daju mogućnost kvalitativne i kvantitativne analize specifičnih antigena
-RIA (RadioImmunoAssay)-antitijela sa radioizotopom
-ELISA ( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-antitijela s enzimom
kako možemo odresiti redoslijed aminokiselina
spektrometrija masa
kako možemo istraživati lipide
MS/MS sustav
MS/MS sustav shema
LC
ionizacija (ESI)
kvadrupol (m/z filter)
kolizija
kvadrupol
detektor, pojačivač signala
nabroji tri mjesta za sintezu lipida
endoplazmatski retikulum
golgijev aparat
mitohondrij kod kvasca
u čemu sve sudjeluju lipidi
u izgradnji membrana i prenošenju signala
kakav tip masnih kiselina je bolji za stanicu kod izgradnje membrana i zašto
nezasićene masne kisleine jer je onda membrana fluidna
struktura lipida membrane arhebakterija
eteri glicerola i dugolančanih alkohola izoprenske strukture
struktura lipida membrane pravih bakterija i eukariota
esteri glicerola tkz. glicerofosfolipidi
kakve masne kiseline po strukturi mogu biti (one koje izgrađuju membrane)
-ravni zasićeni lanci (palmitinska i stereinska)
-ravni nezasićeni lanci, cis dvostruka veza (oleinska)
-razgranati lanci (prokarioti)
-lanci sa ciklopropanom (prokarioti)
šta sve ulazi u građu membrane osim glicerofosfolipida
glikolipidi
steroli (kolesterol, zimosterol, ergosterol)
kojaje uloga sterola u membrani
oni stabiliziraju membranu i povećavaju fluidnost mebrane
-regulacija fluidnosti membrane od birne je važnosti za stanične funkcije, naročito za funkcije proteina u membrani
osnovne funkcije lipida u stanici
-spremište energije i spojeva (m.kis. i steroli) za biogenezu membrana stanice
-polarni lipidi dio su matriksa staničnih membrana
-osim barijere, lipidi omogućavaju pupanje, fuziju i druge promjene membrane koje su preduvijet za procese diobe stanice, reprodukcije i transporta
-lipidi sudjeluju u procesima prijenosa signala/informacija u membrani (hidrofobni dio) i citosolu (hidrofilni dio)
gdje se nalazi respiratorni lanac kod prokariota, a gdje kod eukariota
kod prokariota je na citoplazmidnoj membrani, a kod eukariota na unutrašnjoj strani mitohondrija
osnovne funkcije lipidnog dvosloja
-osmotska barijera
-smještaj proteina membrane koji obavljaju brojne funkcije mebrane
koje su sve funkcije membranskih proteina
-transport tvari u i iz stanice
-fosforilacija
-fotofosforilacija
-oksidoredukcijeske reakcije(respiratorni lanac)
-biosinteza stanične stijenke
-primanje signala iz okoline stanice
-povezivanje citoskeletona i vanjskog omotača
-pretvorba energije potrebne organelima za proces pokretanja
kojim interakcijama su proteini ugrađeni u lipidni dvosloj
hidrofobnim interakcijama
organele s dvostrukom membranom
jezgra
mitohondrij
kloroplast
organele s jednostrukom membranom
endoplazmatski retikulum
golgijev aprat
lizozom
peroksizom
gdje se odvija beta oksidacija
u mitohondrijima
zašto je ATP potreban vezikulama
za dobivanje energije jer je vezikulama za transport nekih tvari potrebna energija
koje izvore energije koristi stanica
-kemijska energija: reducirani spojevi, spojevi sa velikom energijom hidrolize, gradijent protona
-svjetlosna energija
dobivanje ATP-a u kataboličkim reakcijama odvija se na koja tri načina
-fosforilacija u lancu supstrata (citoplazma, glikoliza)
-oksidativna fosforilacija (biomembrane)
-fotofosforilacija (biomembrane)
gdje se odvija oksidativna fosforilacija kod prokariota, a gdje kod eukariota
prokarioti na plazminoj membrani, eukarioti na unutrašnjoj membrani mitohondrija
kod prijenosa elektrona i stvaranja gradijenta protona koje se molekule mogu prenijeti osim protona
NADP/NADPH
molekule koje mogu oksidirati kao što je par piruvat/laktat
koji su spojevi oksidirani, a koji reducirani u anaerobnim respiracijama
oksidirani su organski spojevi ili vodik
reducirani su nitrat, nitrit, ioni željeza, ugljični dioksid, sulfat ili organski spojevi klora