3er Parcial

Question 1

Métodos de secuenciación:

Answer 1

Método químico
- Maxam y Gilbert (radiactividad)
Métodos enzimáticos
- Sanger (radiactividad)
- Automatizado (variación del de sanger- fluorescencia)
Siguiente generación (next- gen sequencing)
- 454- pirosecuenciación
- Illumina (terminador reversible)

Question 2

Etapas fundamentales del método de secuenciación “Maxam y Gilbert”

Answer 2

1. Marcaje del DNA
2. Hidrólisis química específica del DNA
3. Análisis de los productos

Question 3

MARCAJE DEL ADN

método Maxam y Gilbert

Answer 3

• Consiste en marcar uno de los extremos de cada hebra, más comúnmente con polinucleótido cinasa y ATP reactivo.
• En el extremo 5´ el 32P produce señales dispersas en la electroforesis por su elevada energía y los 33P y 35S producen bandas más nítidas.

Question 4

HIDRÓLISIS QUÍMICA ESPECÍFICA DEL ADN

método Maxam y Gilbert

Answer 4

• Para obtener fragmentos de ADN de hebra sencilla, marcados, de longitud variable que terminen en un nucleótido conocido.
• La muestra se divide en 4 alícuotas y cada una de ellas recibe tratamiento químico diferente, con el fin de eliminar separadamente las bases purínicas y las pirimidínicas
• Agentes químicos utilizados: dimetil sulfato (G), ácido fórmico-dimetilsulfato-piperidina (A,G), hidrazina-piperidina (C,T), e hidrazina-1.5M NaCl-piperidina (C).

Question 5

ANALISIS DE LOS PRODUCTOS

método de Maxam y Gilbert

Answer 5

• Las 4 muestras obtenidas se analizan por electroforesis)

Question 6

Método de secuenciación de Sanger

Answer 6

• Se basa en el mecanismo normal de la replicación del ADN.