2-Chromatographie Flashcards
les propriétés communément utilisées pour effectuer le fractionnement sont
- les interactions ioniques (Chromatographie par échange d’ions)
- la taille (Chromatographie par gel-filtration)
- la spécificité (Chromatographie d’affinité)
un échangeur de cations…
porte des groupes chargés négativement (R-) et lierait
des cations de manière réversible
l’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions dépend de
- du pH de la solution
- de la nature et des concentrations des autres ions en solution
les échangeurs utilisés en chromatographie des protéines dépendent de deux
caractéristiques importantes:
- La nature de leur matrice.
- Le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser
l’attachement de la protéine
les matrices utilisées en chromatographie sont…
des polymères insolubles
préparés sous formes de billes, appelées familièrement résines
les polymères le plus souvent utilisés sont…
des polysaccharides comme le cellulose
ou des dérivés du cellulose, de l’agarose ou autres polymères
échangeur fort…
reste
pleinement chargé entre pH ~ 3 et ~ 10
QAE
amine quaternaire - (N+ pKa ~ 9.5) à échangeur anionique fort
sulfonates
échangeur cationique fort.
DEAE
amine tertiaire - partiellement chargé à partir de pH 7 à 8 à
échangeur anionique faible.
CM
carboxyméthyle - pleinement chargé à partir de pH 4.5 à échangeur
cationique faible.
protéines se lient aux échangeurs par…
des forces électrostatiques
plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte, plus la migration est…
lente
procédé d’élution fractionnée
un tampon de
concentration saline supérieure au tampon de lavage
procédé d’élution par gradient
les gradients de sels sont le moyen le plus souvent utilisés afin d’éluer les
protéines adsorbées sur l’échangeur
Sels utilisés pour former des gradients
KCL et NACL
chromatographie par gel-filtration sépare les molécule par…
taille et forme
Les principes de cette méthode: (3)
1- phase stationnaire (résine) xonsiste en un résau de polymères réticulé possédant des pores
2- pores dans les billes du gel laisse rentrer des petites molécules (limite d’exclusion)
3- protéines qui pénètrent pas dans les pores traversent la colonne plus vite
matrices sont faites à partir de quoi…
polymères insolubles à base de polysaccharides comme:
le dextrane, l’agarose ou le polyacrylamide
la porosité des gels dépend de…
la masse moléculaire du polymère
et
nombre de liaisons entre molécules du polymères
qu’est ce que le volume d’élution?
volume de solvant nécéssaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne
Volume total de la colonne= ?
Vt= Vx + Vo
Vx: Volume occupé par les billes
Vo: Volume mort
membranes (saran wrap) utilisés pour la dialyse sont fait de…
cellophane (cellulose)
sous divisons de filtration moléculaire…
filtration moléculaire—-> dialyse—–> centrifugation sur colonne filtre
chromatographie d’affinité
ligand qui lie avec protéine d’intérêt
comment récupérer la protéine dans une chromatographie d’affinité?
- ajout d’excès de ligand libre
- changer pH
- changer force ionique et,ou la température
Kd de l’interation ligand-matrice doit varier entre…
10-4 M et 10-10M et ne doit pas interférer dans l’interaction protéine-ligand
quantité de protéine retenue dépand de (3)…
- du KD’ ( trop faible si plus grand que 10-4M)
- concentration de protéine dans l’extrait
- degré de liaison du ligand à la matrice
matrice utilisée pour la chromatographie d’affinité doit être … (3)
- chimiquement inerte
- avoir uhe grande porosité
- présenter de nombreux groupements fonctionnels
liaison entre matrice d’agarose et ligand se fait en deux temps…
- réaction de l’agarose avec du bromure du cyanogène, qui produit un intermédiaire activé et stable
- ligand réagit avec le l’agarose activé pour donner un produit lié par covalence
Détection des protéines lors de l’élution d’une colonne chromatographique
1) absorption des protéines dans l’UV
2) essai colorimétrique
3) essai enzymatique
4) détection de la protéine sur gel SDS-Page
5) détection avec anti-corps
