wirusy Flashcards
Budowa wirusów
Wirion - pojedyncza aktywna jednostka wirusa, składa się z kapsydu i kwasu nukleinowego
• Kapsyd - płaszcz białkowy, okrywa kwas nukleinowy; zbudowany z łańcuchów białkowych -
kapsomery
• Kwas nukleinowy niesie informację genetyczną niezbędną do replikacji oraz koduje białka
strukturalne (kapsomery) i enzymy (np. odwrotną transkryptazę).
Kwas nukleinowy + kapsyd = nukleokapsyd.
Kwas nukleinowy może być pojedynczy, albo podwójny.
Oprócz tego niektóre wirusy mogą być otoczone dodatkową osłonką lipidową – serotypy uwalniane z
komórki przez pączkowanie
Wyróżnia się dwa jej rodzaje symetrii przestrzennej wirusów:
- symetrię kubiczną, 20 jednakowych trójkątnych ścianek
- symetrię helikalną, śrubowato zawinięty nukleokapsyd
Cechy diagnostyczne pozwalające na odróżnienie wirusy od bakterii:
bezwzględne pasożytnictwo - namnażanie tylko wewn. gospodarza
• małe rozmiary (20-300nm)
• 1 rodzaj kwasu nukleinowego w genomie (DNA (zazwyczaj 2n) lub RNA (zazwyczaj 1n))
• antybiotyki nie działają (brak metabolizmu)
• obecność białka wiążącego receptor (kapsyd/osłonka)
• brak struktur typowo kom. np. rybosomów
Etapy replikacji wirusów w komórce gospodarza
- ADSORPCJA – ważne glikoproteiny w kapsydzie
• Rozpoznanie komórki docelowej
• Przyłączenie do bł. komórkowej
• Po wniknięciu wirusa kom. odporna na zakażenie innymi ( interferencja) - PENETRACJA
• endocytoza / wiropeksja (przy bardzo małych wirusach) - wirus wpukla się z receptorem
• fuzja wirusowej osłonki lipidowej z bł.kom – w osłonce musi znajdować się białko fuzyjne -> zlanie
lipidów
• translokacja - EKLIPSA (zaciemnienie) – brak struktur wirusa w mikroskopie elektronowym
• Odpłaszczenie – uwolnienie materiału genetycznego do komórki gospodarza
• Synteza makromolekuł: wczesne mRNA i białka enzymatyczne (warunkują odtworzenie mat. Gen.);
replikacja genomu; późne mRNA i białka strukturalne
• Obróbka post-translacyjna białek, np. sprzęganie z cukrami - DOJRZEWANIE
• Organizacja potomnych nukleokapsydów – można już zobaczyć w mikroskopie elektronowym
• Opłaszczenie wirusów osłonkowych (błony ER) - UWALNIANIE
• wirusy osłonkowe -> wypączkowanie – kom. gospodarza przeżywa
• wirusy nagie -> liza komórki
Eklipsa (zaciemnienie) – jeden z etapów namnażania wirusów, w której nie zobaczymy struktur wirusa w
mikroskopie elektronowym
- Wirus jest w kom. gospodarza, ale NIE znajdziemy w niej znaleźć kompletnych wirionów.
- Kapsyd rozpada się i uwalnia kwas nukleinowy wirusa
- Kwas nukleinowy wirusa ulega replikacji (powieleniu) - wirus wykorzystuje enzymy z komórki gospodarza.
- Na podstawie informacji genetycznej zawartej w kwasie nukleinowym wirusa komórka produkuje białka
wirusowe zamiast swoich własnych. - Powstają potomne kapsydy.
Latencja wirusów
stadium utajenia wirusa, w którym przyjmuje on formę PROWIRUSA.
• Mat. genetyczny jest wbudowany w genom gospodarza -> kom. gospodarza dzieląc się, przekazuje
komórkom potomnym materiał genetyczny wirusa.
• kilka godzin - kilkadziesiąt lat
• wirus jest niewykrywalny i nieszkodliwy.
• Wirusa w formie latentnej może uaktywnić wiele czynników, np. uraz mechaniczny, temperatura, osłabienie
organizmu inną chorobą; może też zachodzić samoczynnie
• Przykłady:
o herpeswirusy: HSV, EBV, HCMV, HHV3
o papillomawirusy
Efekt cytopatyczny (CPE)
zmiany morfologiczne i degeneracyjne w komórkach, powstające pod wpływem
replikacji wirusa. Są one następstwem zahamowania transkrypcji RNA oraz syntezy białek gospodarza, jak
również toksycznego wpływu białek wirusa.
• Zaokrąglenie
• Wytwarzanie wakuoli we wnętrzu komórki
• Powstawanie wypustki na powierzchni komórek
• Zwiększenie/zmniejszenie rozmiarów komórek.
• Na pow. komórek pojawiają się antygeny wirusowe, np. HA
• Powstawanie syncytiów
Ciała wtrętowe - wjakich chorobach wirusowych mają znaczenie diagnostyczne?
wścieklizna • Cytomegalia • HSV • ospa prawdziwa • Odra
- Namnażanie wirusów – gdzie?
zwierzęta laboratoryjne
• zarodki kurze
• hodowle komórkowe
Linia komórkowa
grupa dzielących się komórek powstałych z podziału komórki pochodzącej z organizmu
wielokomórkowego:
• Hodowle pierwotne – uzyskane z bezpośrednio izolowanych narządów lub świeżych tkanek; niewielka liczba
podziałów
• Hodowle półciągłe - komórki wywodzące się z tkanki płodowej; ok. 30–50 podziałów
• Hodowle ciągłe – nieograniczona liczba podziałów – komórki zmienione nowotworowo -> mają nieprawidłowy
kariotyp – nie można ich wykorzystywać do namnażania wirusów do szczepionek
Źródła komórek używanych do hodowli komórkowych:
• tkanki embrionalne
• tkanki nowotworowe
• tkanki dojrzałe
Linie komórkowe służą do badań mechanizmów leżących u podstawy złośliwości nowotworów oraz umożliwiają
testowanie nowych leków, szczepionek, diagnostyka zakażeń.
Hodowle jednowarstwowe – do obserwacji CPE w mikroskopie
Hodowle w zawiesinie
Hemaglutynina - glikoproteina o właściwościach antygenowych znajdująca się na powierzchni wirusów, np.
grypy:
Funkcje:
Aglutynuje RBC
• Udział w adsorpcji wirusa do receptora komórki
• Warunkuje integrację z receptorem, penetrację i odpłaszczenie
• Czynnik wirulencji
Neuraminidaza – glikoproteina
Działa na nieswoiste inhibitory w środowisku wirusa
• Degradacja kw. sjalowego -> upłynnia śluz -> ułatwia rozprzestrzenianie się wirusa w organizmie
• Umożliwia uwolnienie potomnych wirionów z komórki
Wykrywanie antygenów wirusowych
Testy nieswoiste – np. wstępna identyfikacja ortomyksowirusów, paramyksowirusów (zakażenia u.oddechowego)
z materiałów klinicznych:
- Odczyn hemaglutynacji – zlepianie się RBC w obecności wirusa
- Odczyn hemadsorpcji – przyleganie RBC do powierzchni komórek zarażonych danym wirusem
• Test swoisty – odczyn neutralizacji - identyfikacja wirusa namnożonego w hodowli komórkowej
1) Dodanie wzorcowych przeciwciał do zawiesiny wirusa -> inkubacja
2) Zakażenie wrażliwej linii komórek
3) Wyniki:
a. Zablokowanie wirusa wzorcowymi przeciwciałami neutralizującymi –> brak zakażenia komórek ->
brak CPE -> identyfikacja wirusa na podstawie reaktywności z tymi przeciwciałami
b. X reakcji z przeciwciałami -> zakażenie linii komórkowej -> CPE ->X identyfikacji
PCR – wady i zalety
Zalety
• Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu – wystarczy znajomość
sekwencji nukleotydów w odcinkach otaczających gen
• Startery nie muszą być komplementarne do matrycy w 100% – amplifikacja
wariantów tego samego genu różniących się od siebie niewielkimi zmianami w
sekwencji
• Metoda specyficzna – przy doborze odpowiednich starterów powielaniu ulega
tylko jeden odcinek DNA.
• Metoda czuła – wykrycie i powielenie pojedynczej cząsteczki DNA
• Metoda szybka i tania
Wady Łatwe zanieczyszczenie próbek obcym DNA • Ograniczona długość powielanych fragmentów do 10 tys. pz
Diagnostyka serologiczna wirusów – wykrywanie przeciwciał
OWD
OZHA
ELISA, EIA
OWD – odczyn wiązania dopełniacza – 2 etapy:
1) Układ badany - badana surowica (w której
szukamy przeciwciał), antygen wzorcowy,
dopełniacz odzwierzęcy -> inkubacja razem
2) Układ wskaźnikowy – RBC baranie opłaczone
swoistymi Ig o charakterze lizyn - dodawany po
inkubacji
Wynik:
- (+) W surowicy są Ig -> kompleks z antygenem
wzorcowym -> dołączenie dopełniacza ->
krwinki opadają na dno probówki i tworzą
„guziczek”
- (-) W surowicy X Ig -> dopełniacz łączy się z
układem wskaźnikowym -> liza RBC
OZHA – odczyn zahamowania hemagultynacji
diagnostyka wirusów z HA –> aglutynacja RBC
Np. ortomyksowirusy, paramyksowirusy, wirus różyczki
1) Namnożenie wirusa się w płynie owodniowym zarodka kurzego.
2) Dodanie przeciwciał o określonej swoistości (wzorcowe) – skierowane przeciw wybranym HA
wirusa.
3) Wprowadzenie układu wskaźnikowego - RBC
4) Inkubacja -> ocena obecności lub x aglutynacji
Wynik:
- (+) HA związana z Ig wzorcowymi -> RBC nie będą zlepione przez HA -> opadają na dno
probówki i tworzą „guziczek” = ZAHAMOWANA AGLUTYNACJA
- (-) X kompleksu przeciwciała - HA -> niedopasowanie Ig do typu HA -> zlepienie krwinek
ELISA, EIA – metody immunoenzymatyczne
Wykrywanie różnych klas przeciwciał
• Oznaczenia miana swoistych przeciwciał
Immunochromatografia
Wykorzystanie 2 rodzajów specyficznych Ig - przeciwko wykrywanemu antygenowi:
o 1. – unieruchomione na pasku testowym (nitrocelulozowa membrana)
o 2. – migrujące, znakowane – przenikają na powierzchnię testową
1) Naniesienie próbki materiału na pasek testowy -> uformowane kompleksu antygen (z próbki) – Ig
2) Kompleks migruje wzdłuż paska (dyfuzja) -> połączenie z unieruchomionym Ig -> utworzenie
barwnej linii w określonym miejscu
3) Nadmiar migrujących Ig wiązany jest w obszarze kontrolnym „C” – barwna linia – kontrola
prawidłowego przebiegu reakcji
+: szybkie, proste w wykonaniu -> można w domu, tanie, wysoka czułość, niewielka ilość materiału do
badania
Zasady hybrydyzacji i wykorzystanie w diagnostyce
Hybrydyzacja - spontaniczne parowanie się komplementarnych nici kw.nukleinowych (DNA z DNA, RNA
z RNA, DNA z RNA)
• Hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego -
sondy molekularnej - używa się do detekcji homologicznych fragmentów podczas
• Wykorzystywane w biologii molekularnej metody hybrydyzacyjne pozwalają na umiejscowienie w
cząsteczce DNA określonych sekwencji oraz na porównanie różnych fragmentów kwasów
nukleinowych pochodzących z tego samego lub z różnych organizmów. Za ich pomocą można także
wykrywać powstałe w cząsteczce DNA zmiany.
Metody:
• Hybrydyzacja DNA lub RNA wyizolowanego z próbki ze znakowanymi sondami, np. h.dot blot –
ograniczone zastosowanie ze względu na niską czułość
• Hybrydyzacja metodą Southerna – wykrywanie DNA z wykorzystaniem bł.nylonwej – wysoka czułość
• Hybrydyzacja typu nothern – wykrywanie mRNA genów wirusowych ulegających transkrypcji w kom. z
użyciem bł. nylonowej
• Metody in situ hybrydyzacji kw.nukleinowych – wykrywanie i lokalizacja mat.gen wirusów w
strukturach komórkowych, np. DNA wirusów brodawczaka w preparatach cytologicznych
Jakimi metodami można zidentyfikować wirusa po jego namnożeniu w hodowli komórkowej
A. Metody klasyczne - zakażanie wirusami wrażliwych zwierząt laboratoryjnych, zarodków ptasich i
hodowli komórek - dobiera się je w zależności od ich gatunkowej wrażliwości na danego wirusa,
zakaża się różnymi drogami i obserwuje pojawianie się objawów chorobowych. Gdy takie wystąpią,
@alexkrzywon
zwierzęta uśmierca się i pobiera narządy wewnętrzne (najczęściej mózg, wątrobę i śledzionę), w
których identyfikuje się obecność namnożonego wirusa stosując metody serologiczne.
B. Metody mikroskopowe – wykazywanie obecności wirusów bezpośrednio w materiałach klinicznych
lub w zakażonych komórkach - obserwacja zmian patologicznych powstałych w komórkach
zakażonych wirusem, np. efekt cytopatyczny
C. Metody serologiczne - laboratoryjne metody wykrywania przeciwciał, np. OWD, OZHA ELISA,
odczyn immunofluorescencji
D. Metody molekularne – umożliwiają wykrywanie swoistych sekwencji nukleotydów w wirusowym
DNA lub RNA; wyniki w stosunkowo krótkim czasie.
Szczepionki
Szczepionki przeciwwirusowe mogą zawierać:
Żywe, atenuowane wirusy – zawiera sztucznie otrzymywane odmiany patogenów o znacznie ↓
wirulencji przy zachowaniu ich immunologicznego oddziaływania na organizm, np. odra, świnka,
różyczka, ospa wietrzna, żółta gorączka
• Zabite wirusy
• Rozbite wirusy lub ich wybrane fragmenty
• Rekombinowane antygeny wirusowe - powstają w wyniku wbudowania fragmentu materiału
genetycznego drobnoustroju do komórek ssaków lub komórek drożdży. Zmienione genetycznierekombinowane
- komórki zaczynają produkcję nowego białka, które po wyizolowaniu i
oczyszczeniu staje się antygenem szczepionkowym (np. szczepionka przeciw HPV, HBV)
Typy szczepionek:
Monowalentne – 1 rodzaj wirusa – odporność na jedną chorobę zakaźną
• Poliwalentne – wszystkie lub kilka typów tego samego wirusa - odporność na jedną chorobę
zakaźną, np. przewiko grypie
• Skojarzone – antygeny z różnych drobnoustrojów - odporność przeciwko kilku chorobom
zakaźnych jednocześnie – np. MMR
- Acyklowir
syntetyczny analog nukleozydu guanozyny wbudowanie do wirusowego łańcucha DNA
• (-) replikację kw.nukleionowego herpeswirusów z podrodziny alphaherpesvirinae: HSV1, HSV2,
VZV
1) Genom herpeswirusów: liniowe, dwuniciowe DNA - replikacja w jądrze zakażonej komórki
gospodarza, przy współudziale licznych enzymów wirusowych – kluczowa polimeraza DNA
kodowana przez wirusa
2) Acyklowir wprowadzany jest do komórek przez białko transportujące nukleozydy
3) Wewnątrz komórki enzym kinaza tymidynowa kodowana przez
wirusa przekształca lek w aktywną pochodną fosforanową (lek nie
jest odpowiednim substratem dla kinaz komórkowych – jest
aktywowany w kom. zakażonych przez wirusa – selektywność)
4) Polimeraza wirusowa wprowadza zmodyfikowany nukleozyd do
łańcucha DNA - jego wydłużanie staje się niemożliwe
