Western blot

Question 1

Objetivo

Answer 1

Identificar una proteína de interés. Sirve para encontrar o trabajar ciertas vías de señalización

Question 2

Pasos

Answer 2

1 extracción de proteínas
2 Electroforesis
3 Transferencia
4 Bloqueo
5 Anticuerpos
6 Revelado

Question 3

Extracción de proteínas

Answer 3

• Por Fraccionamiento, lisado completo, etc.
  -Tener una buena curva y adecuado control de carga
  -Métodos para cuantificar: Lowry, Bradfort, Biuret

Question 4

Electroforesis

Answer 4

1 Se coloca la muestra en un buffer de carga
- Confiere carga específica,
quita enlaces disulfuro
Se corre a 60 volts 20 min y después a 100

Question 5

¿Qué ocurre si se pone mucho voltaje?

Answer 5

Se curva la línea de proteínas

Question 6

En qué afecta la concentración del gel

Answer 6

-Más concentrado hay migración más lenta, las moléculas más pesadas permanecen arriba y las pequeñas bajan
-Tiempo de migración
-Para proteínas grandes se baja la concentración del gel

Question 7

Formación de poliacrilamida

Answer 7

Reacción de polimerización iniciada por persulfato y TEMED:
acrilamida +bisacrilamida -> poliacrilamida

Question 8

transferencia

Answer 8

Pasar el gel a una membrana
Tres tipos de cámara
1 cámara húmeda: poner membrana, gel filtro y esponjas
2 Camára semihpumeda
3 cámara seca

Question 9

Para qué sirve el marcador de peso

Answer 9

-Permite al investigador determinar el tamaño relativo de las proteínas o ácidos nucleicos presentes en la muestra de interés al compararlas con las bandas del marcador de peso molecular.
-Ayuda a evaluar la eficiencia de la separación y la calidad del gel, asegurando que las muestras se hayan separado adecuadamente según su tamaño.
-Sirve como una referencia estándar para calibrar el equipo de electroforesis y para verificar que la técnica se está llevando a cabo correctamente.

Question 10

Rojo de ponceau

Answer 10

corroborar que no hubo burbujas que hayan interrumpido la transferencia