Va Extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos Flashcards
Pasos de extracción de DNA genómico
- Muestra de células
- Buffer de lisis
- Precipitación de proteínas
- Precipitración de ácidos nucleicos
- Lavados
- Resuspención en agua libre de nucleasas
- Cuantificación y determinación de pureza
Qué contiene el buffer de lisis?
-50 mM de Tris-HCl para pH 8.0
-1% de SDS (detergente y desnaturalizante)
- Proteinasa K 2mg/ml
Qué incrementa la proteinasa K?
-Pureza del DNA
-Calidad/cantidad de DNA no degradado
Con que se precipitan las proteínas en al extracción de DNA?
Con acetona
Con que se precipita el DNA
Etanol frio
Procedimiento de lavados del DNA
Se lava un par de veces con etanol al 75%
Niveles maximos de espectros de absorbancia de ácidos nucleicos y proteínas
a 260 y 280 nm respectivamente
En base a que absorbancia el espectofotómetro calcula la concentración de ácidos nucleicos en solución?
A 260 nm
Valores de pureza del DNA
1.8 a 2 = optima
1.6 a 1.8 = Aceptable
<1.6 = Contaminación con proteínas
> 2.1 Contaminación con RNA
Con qué metodo se extrae el RNA?
Método fenol-cloroformo
Pasos de la extracción de RNA
- Añadir fenol cloroformo
- Más fenol-cloroformo
- Retirar RNA de fase acuosa y adicionarle isopropanol frio en otro tubo
- Centrifugar
- Lavar 75% etanol
- Resuspender RNA
- Coeficiente 260/280
Niveles de pureza del RNA
Optima = 2.0 a 2.0
Aceptable = >1.7
Contaminación con proteínas = <1.7
Qué es más polar? el fenol o el cloroformo?
El fenol
Gel electroforético principalmente para proteínas o ácidos que requieran mayor resolución
Poliacrilamida
Gel para analisis de muestras de ácidos nucleicos
Gel de agarosa (no se pueden observar diferencias pequeñas)
Tipos de electroforesis mencionadas
Convencional y de campo pulsado
De qué azucares está formada la agarosa del gel de agarosa?
De L-galactosa y D-galactosa
A qué temperatura se hace soluble la agarosa en agua?
a 65°
Concentración tipica de gel de agarosa?
0.5 a 4%
Relación movilidad-concentración de agarosa
A mayor porcentaje de agarosa disminuye la movilidad
Son ejemplos de factores extrínsecos de la partícula en cuanto a movilidad electroforética
- Concentración de agarosa
- Voltaje aplicado
- Tiempo de corrida
- Temperatura
Voltaje tipico aplicado al gel de agarosa
10 V x cm de gel
Absorbancia y emisión del Bromuro de etidio
-Absorbe a 260-360 nm
-Emite a 560 nm
Cuánto detecta el Bromuro de etidio?
Hasta 1ng de dsDNA
Es más sensible el Bromuro de etidio que el SYBR
Verdadero, SYBR (~3ng)
Separación de ácidos nucleicos basada en interacciónes con proteínas
Elecroforesis Mobility Shift Essay (EMSA)
Separación de grandes fragmentos de DNA (hasta millones de pares de bases)
Pulsed field gradient electrophoresis (PFGE)
En la PGFE a qué cadenas les toma menos tiempo relajarse, reorientarse y tienen mayor movilidad?
Las más cortas
Son tipos de campos electricos no homogéneos de PFGE
-PFGE
-OFAGE
-TAF
Son tipos de campos electricos homogéneos de PFGE
-FIGE
-CHEF
-RGE
Cuanto mayor es el tamaño de las cadenas de DNA a separar
mayor es la duración de
los pulsos aplicados y menor el voltaje
Qué analitos llegan primero en la electroforesis capila?
Los cationes (uFeo + ue = mayor movilidad)
Qué analitos llegaran al final en la electroforesis capilar?
Los negativos (uFeo - ue = menor movilidad)
