Utilisation de la fluorescence en biologie

Question 2

spectroscopie

Answer 2

Spectroscopie - étude des spectres

La lumière est un rayonnement (onde électromagnétique) caractérisé par sa
fréquence ou sa longueur d’onde, par son énergie et par son état de polarisation (le sens
de vibration)

Spectroscopie: étude de l’interaction d’ondes
électromagnétiques avec la matière

Question 3

Consequences

Answer 3

modification de l’état
énergétique
Les différents types d’énergie d’une molécule:
Énergie de translation
Énergie rotationnelle
Énergie vibrationnelle
Énergie électronique

Question 4

Spectrométrie d’Absorption

Answer 4

Principe : La spectrométrie d’absorption mesure la quantité de lumière absorbée par un échantillon lorsqu’il est exposé à une radiation électromagnétique

Échantillon soumis à une longueur d’onde variable (( \lambda )) : L’échantillon est exposé à une source de lumière dont la longueur d’onde peut être modifiée. Cela permet d’explorer comment l’échantillon interagit avec différentes longueurs d’onde.

Mesure de l’énergie transmise : Après que la lumière ait traversé l’échantillon, on mesure l’énergie de la radiation qui a réussi à passer à travers. La différence entre l’énergie de la lumière incidente et celle de la lumière transmise indique la quantité d’énergie absorbée par l’échantillon.

Absorption moléculaire ou atomique : L’absorption se produit lorsque les molécules ou les atomes de l’échantillon absorbent l’énergie de la lumière, ce qui peut entraîner des transitions électroniques, vibratoires ou rotationnelles.

Question 5

Spectrométrie d’Émission

Answer 5

Principe : La spectrométrie d’émission mesure la lumière émise par un échantillon après qu’il ait été excité par une source d’énergie.
Processus :
Échantillon soumis à une longueur d’onde d’excitation (( \lambda )) : L’échantillon est exposé à une radiation qui excite les atomes ou les molécules, les amenant à un état d’énergie supérieur.
Mesure de la longueur d’onde émise : Lorsque les atomes ou les molécules retournent à leur état fondamental, ils émettent de la lumière à des longueurs d’onde spécifiques. Cette lumière émise est mesurée pour déterminer les caractéristiques de l’échantillon.
Fluorescence et Émission Atomique : La lumière émise peut être due à des processus de fluorescence (émission de lumière par une substance après absorption de radiation) ou d’émission atomique (comme dans la photométrie de flamme, où les atomes excités émettent de la lumière lorsqu’ils retournent à leur état fondamental).

Question 6

Fluorescence

Answer 6

La fluorescence est l’émission de lumière par une substance après qu’elle ait absorbé de l’énergie, généralement sous forme de lumière ultraviolette ou visible. Ce processus se produit presque instantanément après l’absorption de l’énergie.

elle est souvent utilisée pour analyser des composés tels que les hydrocarbures poly-aromatiques, les composés hétérocycliques et les protéines.

Diagramme de Jablonski>
Absorption : Lorsqu’une molécule absorbe un photon, un électron passe de l’état fondamental (S0) à un état excité (S1 ou S2).
Relaxation Interna : Après l’excitation, la molécule peut perdre une partie de son énergie par des collisions internes, se déplaçant vers un état excité de plus basse énergie (S1). Par exemple une perte d-‘energie de vibration
Émission de Fluorescence : La molécule retourne à l’état fondamental (S0) en émettant un photon, ce qui correspond à la fluorescence.

Question 7

Relation entre emission et excitation

Answer 7

Loi de stokes -
L’énergie est inversement proportionnelle à la longuer d-onde

On observe que les pics d’émission (EM) se situent à des longueurs d’onde plus longues (plus de 700 nm) que les pics d’excitation (EX). Cela illustre le décalage de Stokes, qui est la différence entre la longueur d’onde d’excitation et celle de l’émission. Ce décalage est dû à la perte d’énergie lors de la relaxation interne avant l’émission de fluorescence

La zone de superposition entre les spectres d’absorption et d’émission peut être importante pour certaines applications, car elle peut influencer l’efficacité de l’excitation et la détection de la fluorescence.

Question 8

L’appareillage

Answer 8

-Source lumineuse
-Monochromateurs

Question 9

Les monochromateurs

Answer 9

Fluorimètre : filtres colorés (UG, BG…) ou
interférentiels (S, à bande passante étroite)
Spectrofluorimètre : prisme ou réseau
Intérêt réseau: bande passante plus étroite
Filtres secondaires :
« Long pass »
« Band pass »

Question 10

Microscope cofocale :

Answer 10

Résolution Améliorée : La microscopie confocale offre une meilleure résolution et un meilleur contraste que la microscopie non confocale, car elle élimine la lumière hors foyer.
Imagerie 3D : Elle permet de reconstruire des images en trois dimensions de l’échantillon, ce qui est particulièrement utile pour étudier la structure des cellules et des tissus.
Échantillons Épaissis : Elle est efficace pour l’imagerie d’échantillons plus épais, car elle peut focaliser sur des plans spécifiques.

Question 11

Microscope Non cofocale

Answer 11

Simplicité : La microscopie non confocale est généralement plus simple et moins coûteuse à mettre en œuvre que la microscopie confocale.
Imagerie Rapide : Elle permet d’obtenir des images rapidement, ce qui peut être utile pour des applications nécessitant une acquisition rapide d’images.
Imagerie de Surface : Elle est souvent utilisée pour l’imagerie de surfaces et d’échantillons minces.

Question 12

Interférences possibles

Answer 12

1. Physiques :
   Effet Rayleigh
   Effet Raman
   Effet Tyndal
   2. Chimiques :
      Concentration
      pH
      T
      Solvant ou environnement
      Photo-décomposition
      Auto-fluorescence (mitochondrie
   Exemple de « fading » ou « bleaching »
   -
   Perte progressive de la capacité à f luorescer, par exposi on à la
   lumière.
   Marquage de la tubuline avec des anticorps
   antitubuline alphapuis des anticorps anti IgG marqués
   à la fluorescéine (photos Invitrogen) sur cellules
   endothéliales pulmonaires bovines

Question 13

Characteristiques d’un bon fluorochrome:

Answer 13

Grand écart de Stokes
Rendement quantique élevé
Spectre d’émission dans le visible
Fluorescence distinguable de l’auto-fluorescence de l’échantillon
Si nécessaire, présence d’un groupement permettant de fixer le
fluorochrome de façon covalente sur un réactif spécifique
(sans diminution majeure du rendement quantique

Question 14

Types de fluorochrome

Answer 14

-> Avec affinité pour un constituant cellulaire :
Iodure de propidium, Bromure d’éthidium, DAPI, Hoechst
(ADN)
Acridine orange (ADN et ARN)
Indo-1, fura-2 (calcium)
…
-> Sans affinité propre : doit être fixé sur une
molécule ayant une affinité pour la molécule à
étudier / Ac…
FITC, alexafluor, phycoérythrine, rhodamine…

Question 15

Avantages de la fluorescence :

Answer 15

Sensibilité : concentration détectable de
fluorescéine de l’ordre du 10-13 mol/L
Spécificité : dépend quand même de
nombreux paramètres (matériel, fluorochromes,
nature de l’échantillon….)
Linéarité : dans un domaine de concentrations
plus large

Question 16

Immunoflurescence:

Answer 16

Principe de l’Immunofluorescence
Anticorps : Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire qui se lient spécifiquement à des antigènes (cibles) dans un échantillon. Dans l’immunofluorescence, des anticorps sont utilisés pour cibler des protéines spécifiques.
Marquage Fluorescent : Les anticorps sont conjugués à des fluorochromes, qui sont des molécules capables d’émettre de la lumière lorsqu’elles sont excitées par une source de lumière (généralement une lumière UV ou bleue).
Visualisation : Lorsque l’échantillon est exposé à la lumière excitante, les fluorochromes émettent de la lumière à une longueur d’onde spécifique, permettant de visualiser la localisation des protéines cibles dans les cellules ou les tissus à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Question 17

Immunofluorescence Directe:

Answer 17

Principe
Dans la méthode directe, un anticorps primaire marqué avec un fluorochrome est utilisé pour se lier directement à l’antigène cible dans l’échantillon.
Avantages
Simplicité : La méthode directe est plus simple et nécessite moins d’étapes, car elle n’implique qu’un seul anticorps.
Rapidité : Elle permet une acquisition plus rapide des résultats, car il n’y a pas besoin d’un anticorps secondaire.
Inconvénients
Sensibilité : La méthode directe peut être moins sensible que la méthode indirecte, car elle dépend uniquement de la quantité d’anticorps primaire marqué.

Question 18

Immunofluorescence Indirecte

Answer 18

Dans la méthode indirecte, un anticorps primaire non marqué est d’abord utilisé pour se lier à l’antigène cible. Ensuite, un anticorps secondaire, qui est marqué avec un fluorochrome et qui se lie spécifiquement à l’anticorps primaire, est ajouté.
Avantages
Sensibilité : La méthode indirecte est généralement plus sensible, car plusieurs anticorps secondaires peuvent se lier à un seul anticorps primaire, amplifiant ainsi le signal fluorescent.
Flexibilité : Elle permet d’utiliser un anticorps primaire non marqué provenant de différentes sources, ce qui peut être utile pour des études comparatives.
Inconvénients
Complexité : La méthode indirecte est plus complexe et nécessite plus d’étapes, ce qui peut augmenter le risque d’erreurs.
Temps : Elle prend plus de temps en raison des étapes supplémentaires.

Question 19

Immunofluorescence en sandwich

Answer 19

L’immunofluorescence en sandwich implique l’utilisation de deux anticorps : un anticorps primaire qui se lie à l’antigène cible et un anticorps secondaire qui se lie à l’anticorps primaire. Cela crée une “sandwich” d’anticorps autour de l’antigène.

Étapes de la Méthode :
Fixation de l'Échantillon : L'échantillon (cellules ou tissus) est fixé pour préserver la structure et la localisation des protéines.
Ajout de l'Anticorps Primaire : Un anticorps primaire spécifique à l'antigène d'intérêt est ajouté à l'échantillon. Cet anticorps se lie directement à l'antigène.
Lavage : L'échantillon est lavé pour éliminer les anticorps non liés.
Ajout de l'Anticorps Secondaire : Un anticorps secondaire, qui est conjugué à un fluorochrome, est ajouté. Cet anticorps se lie spécifiquement à l'anticorps primaire.
Lavage : Un autre lavage est effectué pour éliminer les anticorps secondaires non liés.
Visualisation : L'échantillon est observé sous un microscope à fluorescence. La lumière émise par les fluorochromes permet de visualiser la localisation de l'antigène cible.

Avantages de l'Immunofluorescence en Sandwich
Sensibilité Élevée : En utilisant deux anticorps, la méthode en sandwich amplifie le signal fluorescent, ce qui permet de détecter des niveaux très faibles d'antigènes.
Spécificité : La combinaison de l'anticorps primaire et de l'anticorps secondaire augmente la spécificité de la détection, réduisant le risque de faux positifs.
Flexibilité : Cette méthode peut être utilisée pour détecter plusieurs antigènes en utilisant des anticorps secondaires conjugués à différents fluorochromes, permettant une imagerie multicanal.

Question 20

Enzyme labeled fluorescence

Answer 20

Dans cette technique, un anticorps secondaire est conjugué à une enzyme plutôt qu’à un fluorochrome. Les enzymes couramment utilisées incluent la peroxydase de raifort (HRP) et la phosphatase alcaline (AP).

Un substrat spécifique est ajouté à l'échantillon après que l'anticorps marqué par l'enzyme s'est lié à l'antigène cible. L'enzyme catalyse une réaction chimique qui produit un produit coloré ou fluorescent.
Le produit de la réaction enzymatique peut être visualisé par différentes méthodes, y compris la microscopie à fluorescence ou la photométrie. Si le produit est fluorescent, il peut être observé directement sous un microscope à fluorescence. Si le produit est coloré, il peut être visualisé par microscopie optique.

Avantges :
L'utilisation d'enzymes permet d'amplifier le signal, car une seule molécule d'enzyme peut catalyser la conversion de plusieurs molécules de substrat, produisant ainsi un signal plus fort.
Flexibilité : Cette méthode peut être utilisée pour détecter des protéines dans des échantillons fixes ou en solution, et elle peut être adaptée pour des applications variées.
Coût : Les réactifs enzymatiques peuvent parfois être moins coûteux que les fluorochromes, ce qui peut rendre cette méthode plus économique.

Question 21

Avanatges de la fluorescence:

Answer 21

Sensibilité : concentration détectable de
fluorescéine de l’ordre du 10-13 mol/L
Spécificité : dépend quand même de
nombreux paramètres (matériel, fluorochromes,
nature de l’échantillon….)
Linéarité : dans un domaine de concentrations
plus large

Question 22

Problèmes rencontrés

Answer 22

.Sensibilité :
1.Solution 1 : amplification du signal (réactifs IIres ou
méthode ELF en histologie)
2.Solution 2 : augmentation de la stabilité du fluorochrome
Spécificité :
Solution 1 : fluorochrome à écart de Stokes plus large
(phycobiliprotéines)
Solution 2 : fluorimétrie en temps retardé
Solution 3 : FRET = « Fuorescence Resonnance Energy
Transfert

Question 23

L’amplification du signal

Answer 23

Par augmentation de la stabilité du
fluorochrome
Sondes marquées par des
phycobiliprotéines

Question 24

Les phycobiliprotéines

Answer 24

= protéines stables et hautement fluorescentes en
solution, dérivées des cyanobactéries et des algues
eucaryotiques, responsables de la captation de la
lumière et du transfert d’énergie à des molécules de
type Chlorophylle (photosynthèse).
Avantages :
Ecart de Stokes large
Faible quenching par agents externes
Peu d’interférences avec le matériel biologique
Très solubles en milieu aqueux
Nombreux sites réactifs permettant une fixation covalente

Question 25

Problèmes rencontrés (suite)

Answer 25

1.Sensibilité :
1.Solution 1 : amplification du signal (réactifs IIres ou méthode ELF en
histologie)
2.Solution 2 : augmentation de la stabilité du fluorochrome
2. Spécificité
Solution 1 : fluorochrome à écart de Stokes plus large
(phycobiliprotéines)
Solution 2 : fluorimétrie en temps retardé
Solution 3 : FRET = « Fuorescence Resonnance Energy
Transfert

Question 26

La fluorimétrie en temps retardé

Answer 26

Avantages :
 Pic d’émission étroit
 Grand écart de Stokes (ex 340 nm em 613nm)
 Emission de fluorescence longue dans le temps (1000 µs)
Mais fluorescence d’intensité faible en solution d’où l’utilisation
de ligands d’amplification

Question 27

Fluorescence Resonance Energy Transfer
(FRET)

Answer 27

L’énergie d’un donneur excité est transféré par
résonance : l’électron excité induit un champ
électrique oscillant qui entre en résonance avec les
électrons d’une molécule proche, dite réceptrice; à
condition que cette dernière molécule possède la
transition énergétique correspondante…

Question 28

Intérêt de la technique FRET

Answer 28

Dosages sans séparation et sans lavage
Etude de fragmentation / hydrolyse de peptides

 Etude d’association moléculaire :
 -Fusion membranaire
 -Hybridation d’acides nucléiques
 -Liaison ligand- récepteur

Question 29

Quelques applications de la fluorescence

Answer 29

• Resolution of details to the molecular level
  -Study a cell population for viability (some fluorophores penetrate live cells
  and not the dead cells as already explained under microscopy)
  -Detect specific cells of interest in a specimen/material using FISH
  techniques
  -Viewing structural components of cells, bacteria, parasites, fungi and
  bacteria
  -Imaging the genetic material within a cell (DNA and RNA)
  -Defining the spatial-temporal patterns of gene expression within cellApplications de la fluorescence en
  Biologie : quelques exemples…
  Dosages fluorimétriques
  Phase hétérogène
  Phase homogène
  
  Ex1 : méthode TRACE ® ou HTRF® (Homogenous Time resolved
  Fluorescence)
  
  Ex2 : méthode avec polarisation de fluorescence
  Histologie
  Biologie cellulaire sur cellules isolées en culture
  Technologie Taglite® de Cisbio
  Expression de gènes avec la « Green Fluorescent Protein » GFP
  Cytométrie de flux
  Caryotype (ex : méthode FISH)
  « Screening » en biologie moléculaire : biopuces

Question 30

Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Answer 30

Recherche et localisation d’une séquence nucléotidique :
soit sur un chromosome lors d’un caryotype (génétique
moléculaire)
soit sur une puce à ADN ou ARN
Principe :
 la région à étudier est dénaturée (si bicaténaire) et les
protéines associées (dans Chr) sont éliminées,
Une sonde nucléotidique complémentaire est appliquée ;
cette sonde est couplée à un fluorochrome ou porte des
antigènes reconnus par un anticorps fluorescent, utilisé dans
une deuxième étape

Question 31

Exemple d’application d’une puce à ADN

Answer 31

• Fabrication d’ADN complémentaire d’ ARNm
  
  • Marquage avec un fluorochrome « vert » des ADNc
    des cellules témoins
  • Marquage « en rouge » des ADNc des cellules traitées
  • Mélange des 2 lots d’ ADNc
  • Hybridation sur la puce portant les sondes ADN des
    gènes d’intérêt

Question 32

Analyse des résultats

Answer 32

La couleur indique l’influence du traitement sur
l’expression des gènes :
 Rouge : augmentation
 Vert : diminution
 Aussi vert que rouge : peu modifiée
 Pas de couleur : pas d’expressio

Question 33

PCR en temps réel:

Answer 33

« Polymerase Chain Reaction »
* « en temps réel » : Permet de détecter un signal fluorescent émis à
chaque cycle. Plus la concentration de la séquence a détecter est
importante plus tôt le signal de fluorescence apparait.
*
* Mécanisme de FRET d’un rapporteur à l ’extrémité 5’ de la sonde à un
absorbeur à l’extrémité 3’ de la sonde, si la sonde n’est pas clivée
* Technologie TaqMan : l’enzyme utilisée est une ADN polymérase qui a
une activité 5’ nucléase

 Biologie médicale, diagnostic moléculaire :
  Sondes spécifiques d’une zone cible marquées par des fluorochromes 
différents (ex : pour chaque nucléotide pouvant être présent au niveau 
d’un SNP). Selon la sonde qui fluoresce on en déduit l’allèle présente ; 
si les deux sondes fluorescent l’individu est hétérozygote
 * Analyse des aliments :
  Détection de microorganismes pathogènes
  Identification d’allergènes
  Détection d’ OGM (Organismes Génétiquement Modifiés)
  Identification d’espèces animales
 * Ecologie, écotoxicologie
  Détection de microorganismes pathogènes
  Identification d’espèces animales
  Phylogénétique (Branche de la géné que traitant des modifica ons 
géné ques au sein des espèces animales ou végétales

Question 34

Exemples d’applications de la PCR

Answer 34

Biologie médicale, diagnostic moléculaire :
 Sondes spécifiques d’une zone cible marquées par des fluorochromes
différents (ex : pour chaque nucléotide pouvant être présent au niveau
d’un SNP). Selon la sonde qui fluoresce on en déduit l’allèle présente ;
si les deux sondes fluorescent l’individu est hétérozygote
* Analyse des aliments :
 Détection de microorganismes pathogènes
 Identification d’allergènes
 Détection d’ OGM (Organismes Génétiquement Modifiés)
 Identification d’espèces animales
* Ecologie, écotoxicologie
 Détection de microorganismes pathogènes
 Identification d’espèces animales
 Phylogénétique (Branche de la géné que traitant des modifica ons
géné ques au sein des espèces animales ou végétales