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BG - Teste 1 > Unidade 1 - Cenário da Genómica > Flashcards

Unidade 1 - Cenário da Genómica Flashcards

1
Q

Qual é a definição de genómica?

A

Disciplina de mapeamento e sequenciação do genoma, e análise da sua informação.
Mistura de biologia molecular e celular com genética clássica.
Suportada pelas ciências computacionais.

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2
Q

O que é a genómica comparativa?

A

Comparação de genomas de diferentes espécies que permite descobrir a história evolutiva e muitas doenças.

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3
Q

O que foi descoberto em 1960?

A

Código genético

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4
Q

O que foi inventado em 1977?

A

Sequenciação de Sanger

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5
Q

O que foi conseguido em 1980?

A

Clonagem de DNA

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6
Q

O que aconteceu em 1982?

A

Primeira sequência completa de genoma sequenciada - bacteriófago PhiX174

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7
Q

Porque é que se escolheu o bacteriófago PhiX174 para ser o primeiro genoma sequenciado?

A

Por ser um organismo muito simples

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8
Q

O que aconteceu em 1987?

A

Origem da genómica

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9
Q

O que foi iniciado em 1990?

A

Lançamento do HGP (Human Genome Project)

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10
Q

Qual foi o objetivo do HGP?

A

Analisar, mapear e sequenciar compreensivamente todo o genoma humano.

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11
Q

Que recursos foram dispendidos no HGP?

A

10 anos
23 consórcios
1 bilião €

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12
Q

O que aconteceu em 1995?

A

Primeiro genoma de organismo free-living (livre) - Bactéria da influenza (Haemophilus influenzae)

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13
Q

O que aconteceu em 1996?

A

Primeiro genoma eucariota sequenciado - Saccharomyces cerevisiae

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14
Q

Porque foi escolhida a Saccharomyces como primeiro eucariota a ter o seu genoma sequenciado?

A

Por ser um organismo simples, por ser organismo modelo, não levanta questões éticas e fácil de manipular.

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15
Q

O que foi conseguido em 2000?

A

Genoma draft humano

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16
Q

O que é um genoma draft?

A

Um genoma com muitos gaps (zonas não cobertas), cujas sequências podem ser de muito pouca qualidade.
Maioria das seguências genómicas são draft.

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17
Q

O que foi conseguido em 2003?

A

Genoma humano sequenciado.
- cobertura total da eucromatina do genoma e parte da heterocromatina

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18
Q

O que é a eucromatina? E a heterocromatina?

A

Cromatina aberta e ativa.

Cromatina fechada e inerte.

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19
Q

O que aconteceu em 2005?

A

Primeira plataforma de sequenciação de alto rendimento - 454 pirosequenciador

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20
Q

Como funciona o pirosequenciador 454?

A
  • Milhões de leituras por run
  • Maior velocidade e eficiência de sequenciação
  • Envolve a amplificação de fragmentos de DNA por PCR e a sua fixação em micropérolas numa placa PicoTiter (placa de vidro). Cada micropérola contém milhões de cópias de um único fragmento de DNA.
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21
Q

O que aconteceu em 2008?

A

Primeira plataforma de sequenciação de próxima geração (NGS) - Illumina

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22
Q

O que é a plataforma Illumina?

A
  • Tecnologia dominante no campo da genómica
  • Sequenciação por síntese
  • Síntese em tempo real de novos fragmentos de DNA complementares, enquanto o DNA-alvo é sequenciado
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23
Q

O que aconteceu em 2010?

A

Primeiro sequenciador portátil: MinION da Oxford nanopore technologies

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24
Q

Como funciona o sequenciador MinION?

A
  • Usa uma abordagem de sequenciamento por nanoporos, na qual o DNA é passado através de nanoporos minúsculos numa membrana. À medida que o DNA passa pelo nanoporo, bases individuais são identificadas e sequenciadas com base nas mudanças elétricas detetadas.
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25
Q

O que foi impedido em 2013?

A

Tribunal impediu a patente sobre o genoma humano.
Porém, empresas podem patentear genes sintéticos.

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26
Q

O que aconteceu em 2020?

A

Primerio genoma completo sequenciado de um marsupial - diabo da tasmânia (espécie ameaçada pelo cancro contagioso, sendo por isso importante conhecer o seu genoma para estudos)

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27
Q

O que foi criado em 2022?

A

Consórcio “The T2T” (telómero para telómero)

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28
Q

Em que consiste o consórcio “The T2T”?

A
  • O seu objetivo é conseguir aceder aos restantes 8% do genoma humano em falta.
  • 3.055 biliões de bases sequenciadas.
  • Inclui assemblies (alinhamento e fusão de sequencias) sem gaps para todos os cromossomas menos o Y
  • Corrigiu erros dos sequenciamentos anteriores
  • Introduziu perto de 200 milhões de bases, 1956 previsões de genes em que 99 são codificantes de proteínas
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29
Q

Quanto tempo demora para sequenciar um genoma hoje em dia?

A

1 a 3 dias

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30
Q

O que foi criado em 2024?

A

Consórcio de referência do pangenoma humana

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31
Q

Quais são os pilares da genómica?

A

Comprehensiveness (abrangência)
Escala
Tecnologia
Divulgação rápida de dados
Implicações éticas e sociais

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32
Q

Explique o pilar “Comprehensiveness”

A

Refere-se a dados genómicos completos, inclusivos, que abordam todos os aspetos relevantes do genoma de um organismo

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33
Q

Explique o pilar “Escala”

A

Refere-se à quantidade de entidades envolvidas e de recursos humanos destacados, …

34
Q

Explique o pilar “Tecnologia”

A

Referente às tecnologias de análise de dados, mapeamento e sequenciação, que tornam a análise genómica possível

35
Q

Explique o pilar “Divulgação rápida de dados”

A

Refere-se à partilha e disponibilização dos dados ou artigos em base de dados, libertação rápida dos direitos sobre os dados, para que outras identidades os possam usar.

36
Q

Explique o pilar “Implicações éticas e sociais”

A

O estudo deve decorrer de acordo com as normas éticas de trabalho estabelecidas pela legislação em vigor.

37
Q

Qual é a diferença entre genómica e genética?

A

Genómica:
- Ómica - disciplina abrangente/global que estuda um conjunto de moléculas num sistema biológico
- Dedica-se ao estudo da totalidade do genoma
- Permite estudar e mapear variantes genéticas específicas que contribuem para doenças complexas e mendelianas

Genética:
- Estudo dos genes, hereditariedade e variações genéticas

38
Q

O método de sequenciação de Sanger mede segmentos de que tamanho?

A

800 a 1000 pares de bases
Melhores <500 bp

39
Q

O sequenciamento de Sanger é de leitura longa ou curta?

A

Curta

40
Q

O sequenciamento de Sanger tem 4 características principais. Quais?

A
  • Sequenciação por terminação de cadeia
  • Dispendioso e moroso
  • Baixo rendimento, mas ainda muito usado
  • Muito propenso a erros (por isso analisa-se a sequencia direta e reversa
41
Q

Como funciona o sequenciamento de Sanger?

A

Preparação da amostra:
- isola-se o fragmento de DNA (extração do DNA da célula e/ou amplifiação por PCR)

Sequenciamento:
- o fragmento passa por 4 reações separadas, cada uma com uma base diferente, DNA polimerase, primers iniciadores e ddNTPs

Incorporação dos ddNTPs:
- nucleótidos modificados que impedem a adição de mais nucleótidos

Separação por eletroforese:
- eletroforese de gel de poliacrilamida ou capilar

Deteção e análise:
- os fragmentos separados passam por um detetor que os identifica por fluorescência dos ddNTPs

42
Q

Onde se encontram as polimorfias e mutações no genoma mitocondrial?

A

Nas regiões hipervariáveis (HV1, HV2, HV3)

43
Q

Qual é a sequência padrão para comparação de genoma mitocondrial?

A

Sequência de Anderson

44
Q

A bactéria influenza é gram…?

A

Gram negativa

45
Q

Dá 3 exemplos de doenças provocadas pela influenza.

A
  • Pneumonia
  • Infeção sanguínea
  • Meningite
  • Epiglotite
  • Celulite
  • Artrite infeciosa
  • Infeções nos ouvidos ou bronquite
46
Q
A
47
Q

Qual o tamanho do genoma da Saccharomyces, e que parte é codificante?

A

Genoma: 12 milhões de bps
- 6000 genes codificantes de proteínas

48
Q

Diz 2 exemplos de como a Saccharomyces foi modificada por domesticação humana.

A

Cães - dieta rica em amido
Galinhas - perda de acasalamento sazonal
Toranja - pode aumentar o efeito de alguns medicamentos
Mosca da fruta - letargia, falta de movimento

49
Q

Quais são as plataformas de sequenciação de 1ª geração?

A

Sequenciamento de leitura curta:
- Sequenciamento de Sanger
- Maxam e Gilbert

50
Q

Quais são as plataformas de sequenciação de 2ª geração (NGS)?

A

Sequenciamento de leitura curta:
- 454
- Solexa
- Illumina
- Ion Torrent

51
Q

Quais são as plataformas de sequenciação de 3ª geração?

A

Sequenciamento de leitura longa:
- PacBio
- MinION Oxford nanopore

52
Q

Que gerações de sequenciamento são de leitura longa?

A

3ª

1ª e 2ª - leitura curta

53
Q

Que tipos de sequenciamento existem?

A
  • WGS (sequenciamento total do genoma)
  • WES (sequenciamento total do exoma)
  • TS (sequenciamento de alvo)
  • WTS (sequenciamento total do transcriptoma)
54
Q

Que métodos existem para WGS?

A
  • Shot-gun sequencing
55
Q

O que é o método “Shot-gun sequencing”?

A
  • Baseia-se no método de Sanger
  • A molécula de DNA é fragmentada em pedaços menores, que são sequenciados individualmente.
  • As sequências resultantes são sobrepostas e montadas para reconstruir a sequência completa do genoma
56
Q

Diz 3 vantagens do WGS.

A
  • Cobertura mais abrangente (zonas codificantes e não codificantes)
  • Maior nº de características detetadas; permite a deteção de todas as variações genéticas (SNVs, indels, CNVs e SVs)
  • Sem parcialidades pelo PCR
  • Melhor para investigação
57
Q

Que tipos de variações genéticas existem?

A

SNV - single-nucleotide variant
indel - inserções e deleções
CNV - copy number variations
SV - variações estruturais

58
Q

Diz 3 desvantagens do WGS?

A
  • Muitos dados potencialmente desncessários
  • Dados muito complexos
  • Não é possível multiplexar
  • Lento
  • Dispendioso
  • Grande quantidade de dados
  • Análise complexa
59
Q

O que significa “multiplexar”?

A

Capacidade de analisar múltiplas regiões do genoma ou realizar múltiplos ensaios genómicos numa única etapa experimental

60
Q

Quando se usa WGS?

A
  • Cobertura completa do genoma
  • Construção de novo
  • Descoberta de novas variantes genéticas
  • Deteção de aneuploidia
  • Genética populacional
  • Estudos evolutivos
  • Diagnósticos clínicos
61
Q

Diz 3 vantagens de WES.

A
  • Cobertura só das regiões codificantes de proteínas (exoma = 1-2% genoma total)
  • Fluxo de trabalho mais rápido
  • Multiplex de amostras
  • Mais custo-eficiente do que WGS
  • Menos complexo
62
Q

Diz 3 desvantagens de WES.

A
  • Só analisa dados presentes em exões, pode falhar variantes funcionais
  • Pode gerar dados a mais do que requerido
  • Média velocidade
  • Menor quantidade de dados
  • Preço médio
63
Q

Quando se usa WES?

A
  • Diagnósticos clínicos
  • Descobertas de doenças raras
  • Genómica de cancro
  • Estudos focados nas variações do código associadas a doenças ou fenótipos
  • Identificar variantes genéticas com efeitos funcionais, como mutações missense, nonsense e indels
64
Q

Em que consiste a TS?

A
  • Cobertura de um pequeno número de genes ou regiões alvo de interesse, que podem ser personalizados com base nas necessidades
  • Menor input de amostra
65
Q

Diz 3 vantagens de TS.

A
  • Mais rápida
  • Baixo custo
  • Flexibilidade na seleção do alvo
  • Dados muito específicos na região de interesse
  • Amostras pequenas
  • Compatível com tecidos FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded)
  • Multiplex de grande nº de amostras
  • Melhor para detetar alelos raros; Elevada sensibilidade para deteção de vaiantes
66
Q

Diz 3 desvantagens de TS.

A
  • Só dados das regiões alvo
67
Q

Quando se usa TS?

A
  • Resequenciação target de genes candidatos
  • Regiões específicas (panels) que permitam descobrir certas predisposições a doenças
  • Sequenciamento genómico microbiano
  • Sequenciamento de amplicões para detetar bactérias e vírus
  • Análise seletiva de regiões genómicas para questões particulares ou fenótipos clínicos
68
Q

Dá um exemplo que uma tecnologia TS.

A

Ion Ampliseq:
- PCR multiplex (análise de vários loci) ultra-elevado para resequenciamento alvo (vários milhares de alvos)
- Serviço personalizado: bioinformática, química, sistema-específico
- Começa com apenas 10 ng de DNA, por 10 horas

69
Q

O que é o WTS?

A

WTS (Sequenciamento total do transcriptoma)
- Informa sobre formas de RNA codificante e não codificante - verifica variações e níveis de expressão genética
- Transcriptoma está em constante mudança
- Fornece indicações preciosas sobre expressão genética e área medicinal
- Deteção de sequências por diferenças no pH

70
Q

Que medidas são importantes em NGS?

A
  • Leituras (quanto maior quantidade de leituras, melhor é o resultado)
  • Cobertura (cobertura total significa que não existem áreas do genoma por ler)
71
Q

Porque é necessária a preparação de uma biblioteca para a NGS de genomas?

A
  • Converte as amostras nucleicas complexas num formato percetível
  • Assegura que existe material suficiente para sequenciar
  • Sequenciamento mais eficiente
  • Serve para armazenar o conjunto de fragmentos que se pretendem sequenciar
72
Q

Para que servem os adaptadores na preparação de bibliotecas de DNA?

A
  • Sequências curtas de DNA sintético que estão ligadas às pontas do DNA ou RNA fragmentado durante a preparação das bibliotecas
  • Contêm sequências complementares aos primers usados na sequenciação
  • Locais de ligação aos primers permitem a plataforma de sequenciação sintetizar o DNA em locais específicos dos fragmentos de DNA ou RNA
  • Códigos de barras usados para multiplexing
  • Cada amostra é marcada com um código de barras único no adpatador, permitindo a sua distinção
  • Adaptadores contêm sequências que facilitam a ligação do DNA e RNA à superfície da plataforma de sequenciamento - necessários para imobilizar estes fragmentos e facilitar o sequencimento
73
Q

O que é um Ionograma?

A

Gráfico que representa o nível de iões numa amostra.
- Lido de cima para baixo, e da esquerda para a direita
- Altura da barra indica os nucleótidos incorporados durante a leitura

74
Q

O que é um Eletroferograma?

A

Gráfico que representa os resultados da eletroforese.

75
Q

Métodos NGS sequenciam que ácidos nucleicos?

A

DNA e RNA

76
Q

Qual é o processo de NGS?

A

Coletar amostras -> purificar -> RNA é transcrito em DNA -> biblioteca de DNA -> PCR

77
Q

Na tecnologia Illumina, qual das cadeias é que se liga ao oligonucleótido da placa?

A

Cadeia frontal - a que se liga ao oligonucleótido

Cadeia reversa - a que se forma

78
Q

Que métodos podem ser usados para sequenciar DNA?

A
  • TS (sequencialmento alvo)
  • WGS (total do genoma)
  • WES (total do exoma)
  • Protein binding (Chipseq)
  • Metilação
  • cfDNA
79
Q

Que métodos podem ser usados para sequenciar RNA?

A
  • WTS (total do transcriptoma)
  • TS (sequencialmento alvo)
  • RNA não codificante (miRNA e IncRNA)
  • Células únicas
80
Q

Na tecnologia Ion Torrent, que técnica é usada para sequenciar o DNA?

A

Mudanças de pH, causadas pela libertação de protões aquando da adição de novos nucleótidos.
A mudança de pH é detetada e transformada em sinais elétricos que depois são lidos no software.

81
Q

Quais são os 4 passos na sequenciação por Ion Torrent?

A

1) Preparação da biblioteca
2) PCR de emulsão
3) Carregamento do chip Ion
4) Processamento de sinal

82
Q

Explica cada passo da sequenciação por Ion Torrent.
(Preparação da biblioteca; PCR de emulsão; Carregamento do chip Ion; Processamento de sinal)

A

1) Preparação da biblioteca
- Criação de fragmentos de DNA por sonicação e adição de adaptadores

2) PCR de emulsão
- O DNA é colocado numa solução de água com microvesículas que contêm sequências de oligonucleótidos complementares aos adaptadores adicionados
- Cada microvesícula só tem um tipo de oligo
- Adição de um óleo e mistura de PCR -> cada vesícula fica presa e isolada na sua bolha de óleo com o seu fragmento de DNA
- Dentro da vesícula tem tudo necessário para fazer replicação de DNA até toda a vesícula estar coberta por cópias do mesmo fragmento

3) Carregamento do chip Ion
- O chip tem milhões de micropoços onde cabe apenas uma microvesícula por micropoço
- O sistema é inundado com uma solução de apenas um nucleótido
- Caso haja adição da base numa das sequências das vesículas, vai haver libertação de milhões de protões, alterando assim o pH, que permite detetar a adição na cadeia
- Caso não haja adição, é feita uma lavagem e depois uma nova solução com uma base diferente é adicionada

4) Processamento de sinal
- Análise dos dados obtidos pelo chip
- Não é necessário marcar as bases

BG - Teste 1 (5 decks)

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