Unidade 1 - Cenário da Genómica Flashcards
Qual é a definição de genómica?
Disciplina de mapeamento e sequenciação do genoma, e análise da sua informação.
Mistura de biologia molecular e celular com genética clássica.
Suportada pelas ciências computacionais.
O que é a genómica comparativa?
Comparação de genomas de diferentes espécies que permite descobrir a história evolutiva e muitas doenças.
O que foi descoberto em 1960?
Código genético
O que foi inventado em 1977?
Sequenciação de Sanger
O que foi conseguido em 1980?
Clonagem de DNA
O que aconteceu em 1982?
Primeira sequência completa de genoma sequenciada - bacteriófago PhiX174
Porque é que se escolheu o bacteriófago PhiX174 para ser o primeiro genoma sequenciado?
Por ser um organismo muito simples
O que aconteceu em 1987?
Origem da genómica
O que foi iniciado em 1990?
Lançamento do HGP (Human Genome Project)
Qual foi o objetivo do HGP?
Analisar, mapear e sequenciar compreensivamente todo o genoma humano.
Que recursos foram dispendidos no HGP?
10 anos
23 consórcios
1 bilião €
O que aconteceu em 1995?
Primeiro genoma de organismo free-living (livre) - Bactéria da influenza (Haemophilus influenzae)
O que aconteceu em 1996?
Primeiro genoma eucariota sequenciado - Saccharomyces cerevisiae
Porque foi escolhida a Saccharomyces como primeiro eucariota a ter o seu genoma sequenciado?
Por ser um organismo simples, por ser organismo modelo, não levanta questões éticas e fácil de manipular.
O que foi conseguido em 2000?
Genoma draft humano
O que é um genoma draft?
Um genoma com muitos gaps (zonas não cobertas), cujas sequências podem ser de muito pouca qualidade.
Maioria das seguências genómicas são draft.
O que foi conseguido em 2003?
Genoma humano sequenciado.
- cobertura total da eucromatina do genoma e parte da heterocromatina
O que é a eucromatina? E a heterocromatina?
Cromatina aberta e ativa.
Cromatina fechada e inerte.
O que aconteceu em 2005?
Primeira plataforma de sequenciação de alto rendimento - 454 pirosequenciador
Como funciona o pirosequenciador 454?
- Milhões de leituras por run
- Maior velocidade e eficiência de sequenciação
- Envolve a amplificação de fragmentos de DNA por PCR e a sua fixação em micropérolas numa placa PicoTiter (placa de vidro). Cada micropérola contém milhões de cópias de um único fragmento de DNA.
O que aconteceu em 2008?
Primeira plataforma de sequenciação de próxima geração (NGS) - Illumina
O que é a plataforma Illumina?
- Tecnologia dominante no campo da genómica
- Sequenciação por síntese
- Síntese em tempo real de novos fragmentos de DNA complementares, enquanto o DNA-alvo é sequenciado
O que aconteceu em 2010?
Primeiro sequenciador portátil: MinION da Oxford nanopore technologies
Como funciona o sequenciador MinION?
- Usa uma abordagem de sequenciamento por nanoporos, na qual o DNA é passado através de nanoporos minúsculos numa membrana. À medida que o DNA passa pelo nanoporo, bases individuais são identificadas e sequenciadas com base nas mudanças elétricas detetadas.
O que foi impedido em 2013?
Tribunal impediu a patente sobre o genoma humano.
Porém, empresas podem patentear genes sintéticos.
O que aconteceu em 2020?
Primerio genoma completo sequenciado de um marsupial - diabo da tasmânia (espécie ameaçada pelo cancro contagioso, sendo por isso importante conhecer o seu genoma para estudos)
O que foi criado em 2022?
Consórcio “The T2T” (telómero para telómero)
Em que consiste o consórcio “The T2T”?
- O seu objetivo é conseguir aceder aos restantes 8% do genoma humano em falta.
- 3.055 biliões de bases sequenciadas.
- Inclui assemblies (alinhamento e fusão de sequencias) sem gaps para todos os cromossomas menos o Y
- Corrigiu erros dos sequenciamentos anteriores
- Introduziu perto de 200 milhões de bases, 1956 previsões de genes em que 99 são codificantes de proteínas
Quanto tempo demora para sequenciar um genoma hoje em dia?
1 a 3 dias
O que foi criado em 2024?
Consórcio de referência do pangenoma humana
Quais são os pilares da genómica?
Comprehensiveness (abrangência)
Escala
Tecnologia
Divulgação rápida de dados
Implicações éticas e sociais
Explique o pilar “Comprehensiveness”
Refere-se a dados genómicos completos, inclusivos, que abordam todos os aspetos relevantes do genoma de um organismo
Explique o pilar “Escala”
Refere-se à quantidade de entidades envolvidas e de recursos humanos destacados, …
Explique o pilar “Tecnologia”
Referente às tecnologias de análise de dados, mapeamento e sequenciação, que tornam a análise genómica possível
Explique o pilar “Divulgação rápida de dados”
Refere-se à partilha e disponibilização dos dados ou artigos em base de dados, libertação rápida dos direitos sobre os dados, para que outras identidades os possam usar.
Explique o pilar “Implicações éticas e sociais”
O estudo deve decorrer de acordo com as normas éticas de trabalho estabelecidas pela legislação em vigor.
Qual é a diferença entre genómica e genética?
Genómica:
- Ómica - disciplina abrangente/global que estuda um conjunto de moléculas num sistema biológico
- Dedica-se ao estudo da totalidade do genoma
- Permite estudar e mapear variantes genéticas específicas que contribuem para doenças complexas e mendelianas
Genética:
- Estudo dos genes, hereditariedade e variações genéticas
O método de sequenciação de Sanger mede segmentos de que tamanho?
800 a 1000 pares de bases
Melhores <500 bp
O sequenciamento de Sanger é de leitura longa ou curta?
Curta
O sequenciamento de Sanger tem 4 características principais. Quais?
- Sequenciação por terminação de cadeia
- Dispendioso e moroso
- Baixo rendimento, mas ainda muito usado
- Muito propenso a erros (por isso analisa-se a sequencia direta e reversa
Como funciona o sequenciamento de Sanger?
Preparação da amostra:
- isola-se o fragmento de DNA (extração do DNA da célula e/ou amplifiação por PCR)
Sequenciamento:
- o fragmento passa por 4 reações separadas, cada uma com uma base diferente, DNA polimerase, primers iniciadores e ddNTPs
Incorporação dos ddNTPs:
- nucleótidos modificados que impedem a adição de mais nucleótidos
Separação por eletroforese:
- eletroforese de gel de poliacrilamida ou capilar
Deteção e análise:
- os fragmentos separados passam por um detetor que os identifica por fluorescência dos ddNTPs
Onde se encontram as polimorfias e mutações no genoma mitocondrial?
Nas regiões hipervariáveis (HV1, HV2, HV3)
Qual é a sequência padrão para comparação de genoma mitocondrial?
Sequência de Anderson
A bactéria influenza é gram…?
Gram negativa
Dá 3 exemplos de doenças provocadas pela influenza.
- Pneumonia
- Infeção sanguínea
- Meningite
- Epiglotite
- Celulite
- Artrite infeciosa
- Infeções nos ouvidos ou bronquite
Qual o tamanho do genoma da Saccharomyces, e que parte é codificante?
Genoma: 12 milhões de bps
- 6000 genes codificantes de proteínas
Diz 2 exemplos de como a Saccharomyces foi modificada por domesticação humana.
Cães - dieta rica em amido
Galinhas - perda de acasalamento sazonal
Toranja - pode aumentar o efeito de alguns medicamentos
Mosca da fruta - letargia, falta de movimento
Quais são as plataformas de sequenciação de 1ª geração?
Sequenciamento de leitura curta:
- Sequenciamento de Sanger
- Maxam e Gilbert
Quais são as plataformas de sequenciação de 2ª geração (NGS)?
Sequenciamento de leitura curta:
- 454
- Solexa
- Illumina
- Ion Torrent
Quais são as plataformas de sequenciação de 3ª geração?
Sequenciamento de leitura longa:
- PacBio
- MinION Oxford nanopore
Que gerações de sequenciamento são de leitura longa?
3ª
1ª e 2ª - leitura curta
Que tipos de sequenciamento existem?
- WGS (sequenciamento total do genoma)
- WES (sequenciamento total do exoma)
- TS (sequenciamento de alvo)
- WTS (sequenciamento total do transcriptoma)
Que métodos existem para WGS?
- Shot-gun sequencing
O que é o método “Shot-gun sequencing”?
- Baseia-se no método de Sanger
- A molécula de DNA é fragmentada em pedaços menores, que são sequenciados individualmente.
- As sequências resultantes são sobrepostas e montadas para reconstruir a sequência completa do genoma
Diz 3 vantagens do WGS.
- Cobertura mais abrangente (zonas codificantes e não codificantes)
- Maior nº de características detetadas; permite a deteção de todas as variações genéticas (SNVs, indels, CNVs e SVs)
- Sem parcialidades pelo PCR
- Melhor para investigação
Que tipos de variações genéticas existem?
SNV - single-nucleotide variant
indel - inserções e deleções
CNV - copy number variations
SV - variações estruturais
Diz 3 desvantagens do WGS?
- Muitos dados potencialmente desncessários
- Dados muito complexos
- Não é possível multiplexar
- Lento
- Dispendioso
- Grande quantidade de dados
- Análise complexa
O que significa “multiplexar”?
Capacidade de analisar múltiplas regiões do genoma ou realizar múltiplos ensaios genómicos numa única etapa experimental
Quando se usa WGS?
- Cobertura completa do genoma
- Construção de novo
- Descoberta de novas variantes genéticas
- Deteção de aneuploidia
- Genética populacional
- Estudos evolutivos
- Diagnósticos clínicos
Diz 3 vantagens de WES.
- Cobertura só das regiões codificantes de proteínas (exoma = 1-2% genoma total)
- Fluxo de trabalho mais rápido
- Multiplex de amostras
- Mais custo-eficiente do que WGS
- Menos complexo
Diz 3 desvantagens de WES.
- Só analisa dados presentes em exões, pode falhar variantes funcionais
- Pode gerar dados a mais do que requerido
- Média velocidade
- Menor quantidade de dados
- Preço médio
Quando se usa WES?
- Diagnósticos clínicos
- Descobertas de doenças raras
- Genómica de cancro
- Estudos focados nas variações do código associadas a doenças ou fenótipos
- Identificar variantes genéticas com efeitos funcionais, como mutações missense, nonsense e indels
Em que consiste a TS?
- Cobertura de um pequeno número de genes ou regiões alvo de interesse, que podem ser personalizados com base nas necessidades
- Menor input de amostra
Diz 3 vantagens de TS.
- Mais rápida
- Baixo custo
- Flexibilidade na seleção do alvo
- Dados muito específicos na região de interesse
- Amostras pequenas
- Compatível com tecidos FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded)
- Multiplex de grande nº de amostras
- Melhor para detetar alelos raros; Elevada sensibilidade para deteção de vaiantes
Diz 3 desvantagens de TS.
- Só dados das regiões alvo
Quando se usa TS?
- Resequenciação target de genes candidatos
- Regiões específicas (panels) que permitam descobrir certas predisposições a doenças
- Sequenciamento genómico microbiano
- Sequenciamento de amplicões para detetar bactérias e vírus
- Análise seletiva de regiões genómicas para questões particulares ou fenótipos clínicos
Dá um exemplo que uma tecnologia TS.
Ion Ampliseq:
- PCR multiplex (análise de vários loci) ultra-elevado para resequenciamento alvo (vários milhares de alvos)
- Serviço personalizado: bioinformática, química, sistema-específico
- Começa com apenas 10 ng de DNA, por 10 horas
O que é o WTS?
WTS (Sequenciamento total do transcriptoma)
- Informa sobre formas de RNA codificante e não codificante - verifica variações e níveis de expressão genética
- Transcriptoma está em constante mudança
- Fornece indicações preciosas sobre expressão genética e área medicinal
- Deteção de sequências por diferenças no pH
Que medidas são importantes em NGS?
- Leituras (quanto maior quantidade de leituras, melhor é o resultado)
- Cobertura (cobertura total significa que não existem áreas do genoma por ler)
Porque é necessária a preparação de uma biblioteca para a NGS de genomas?
- Converte as amostras nucleicas complexas num formato percetível
- Assegura que existe material suficiente para sequenciar
- Sequenciamento mais eficiente
- Serve para armazenar o conjunto de fragmentos que se pretendem sequenciar
Para que servem os adaptadores na preparação de bibliotecas de DNA?
- Sequências curtas de DNA sintético que estão ligadas às pontas do DNA ou RNA fragmentado durante a preparação das bibliotecas
- Contêm sequências complementares aos primers usados na sequenciação
- Locais de ligação aos primers permitem a plataforma de sequenciação sintetizar o DNA em locais específicos dos fragmentos de DNA ou RNA
- Códigos de barras usados para multiplexing
- Cada amostra é marcada com um código de barras único no adpatador, permitindo a sua distinção
- Adaptadores contêm sequências que facilitam a ligação do DNA e RNA à superfície da plataforma de sequenciamento - necessários para imobilizar estes fragmentos e facilitar o sequencimento
O que é um Ionograma?
Gráfico que representa o nível de iões numa amostra.
- Lido de cima para baixo, e da esquerda para a direita
- Altura da barra indica os nucleótidos incorporados durante a leitura
O que é um Eletroferograma?
Gráfico que representa os resultados da eletroforese.
Métodos NGS sequenciam que ácidos nucleicos?
DNA e RNA
Qual é o processo de NGS?
Coletar amostras -> purificar -> RNA é transcrito em DNA -> biblioteca de DNA -> PCR
Na tecnologia Illumina, qual das cadeias é que se liga ao oligonucleótido da placa?
Cadeia frontal - a que se liga ao oligonucleótido
Cadeia reversa - a que se forma
Que métodos podem ser usados para sequenciar DNA?
- TS (sequencialmento alvo)
- WGS (total do genoma)
- WES (total do exoma)
- Protein binding (Chipseq)
- Metilação
- cfDNA
Que métodos podem ser usados para sequenciar RNA?
- WTS (total do transcriptoma)
- TS (sequencialmento alvo)
- RNA não codificante (miRNA e IncRNA)
- Células únicas
Na tecnologia Ion Torrent, que técnica é usada para sequenciar o DNA?
Mudanças de pH, causadas pela libertação de protões aquando da adição de novos nucleótidos.
A mudança de pH é detetada e transformada em sinais elétricos que depois são lidos no software.
Quais são os 4 passos na sequenciação por Ion Torrent?
1) Preparação da biblioteca
2) PCR de emulsão
3) Carregamento do chip Ion
4) Processamento de sinal
Explica cada passo da sequenciação por Ion Torrent.
(Preparação da biblioteca; PCR de emulsão; Carregamento do chip Ion; Processamento de sinal)
1) Preparação da biblioteca
- Criação de fragmentos de DNA por sonicação e adição de adaptadores
2) PCR de emulsão
- O DNA é colocado numa solução de água com microvesículas que contêm sequências de oligonucleótidos complementares aos adaptadores adicionados
- Cada microvesícula só tem um tipo de oligo
- Adição de um óleo e mistura de PCR -> cada vesícula fica presa e isolada na sua bolha de óleo com o seu fragmento de DNA
- Dentro da vesícula tem tudo necessário para fazer replicação de DNA até toda a vesícula estar coberta por cópias do mesmo fragmento
3) Carregamento do chip Ion
- O chip tem milhões de micropoços onde cabe apenas uma microvesícula por micropoço
- O sistema é inundado com uma solução de apenas um nucleótido
- Caso haja adição da base numa das sequências das vesículas, vai haver libertação de milhões de protões, alterando assim o pH, que permite detetar a adição na cadeia
- Caso não haja adição, é feita uma lavagem e depois uma nova solução com uma base diferente é adicionada
4) Processamento de sinal
- Análise dos dados obtidos pelo chip
- Não é necessário marcar as bases
