Transkripce Flashcards
Gen (3 druhy)
- = Základní jednotka dědičné informace
- kus NK, který se dědí a má nějaký projev
- 1.Gen kódující protein: jako jediné využívají mRNA k translaci
- 2.Gen kódující RNA: kóduje tRNA, rRNA, snRNA, miRNA…
- 3.Regulační nebo strukturní oblast: promotory, enhancery, centromery, telomery
Čím je dáno množství exprese na úrovni transkripce (=množství primárního transkriptu)?
- Je dáno silou promotoru a počtem kopií genu
Primární transkript
- velmi nestabilní
- bicistronní transkripce U VŠECH
- geny kódující mRNA jsou VŽDY POLYCISTRONNÍ
BAKTERIE, ARCHEA: - rychlá degradace
- regulace genové exprese během iniciace transkripce
- polycistronní transkripce = více genů pod jedním promotorem (Lac operon)
EUKARYOTA: - častěji posttranskripční modifikace
- mRNA je stabilnější
- T1/2 mRNA = 12 min
- ne vždy, ale spíše monocistronní transkripce
- polycistronní: Nematoda, Trypanosomy, Drosophila
Bakteriální transkripce
- není izolovaná od translace, je s ní úzce spojená a závislá
- relativně nízká variabilita v promotorech a omezený počet TFs
- mRNA není obvykle posttranskripčně modifikovaná, ale je rovnou použitá
- Ribosom se váže IHNED po zahájení transkripce (na co čekat)
- jen 1 RNA pol.
Bakteriální RNA pol.
- jen jedna
- na rozdíl od eukaryota má vnitřní afinitu k DNA -> většinu času tráví někde navázaná na DNA
- hlavní způsob regulace transkripce je represe (u Eukaryota je úplný opak, tam jsou aktivátory)
- pokud nemá transkripce probíhat, musí být promotor reprimován
DIMER 2x α: - vazba β podjednotek k sobě
- vazba aktivátorů
β PODJEDNOTKA: - katalytická podj.
β’ PODJEDNOTKA: - vazba k templátu
FAKTOR σ: - ATPázová aktivita
- zodpovědný za specifitu k promotoru
. navázání σ faktoru a RNA pol. na DNA -> otevření DNA -> zahájení transkripce - Faktor σ70 - promotory, které jsou neustále funkční, za normálních podmínek je zodpovědný za iniciaci transkripce
- Speciální σ faktory pro specifické podmínky - rychlé přizpůsobení (teplotní šok, hladovění…)
NEESENCIÁLNÍ PODJEDNOTKY: - nejsou nutné, ale vliv na fitness
- ω podjednotka - stabilizace celého komplexu
- Delta, epsilon podjednotky - hl. G+ bakterie
Iniciace transkripce u bakterií + promotor
- σ podjednotka rozpozná consensus sekvenci
- Rozpoznání promotoru - vazba RNA pol. na DNA a syntéza prvního nukleotidu
- Negativní nadobrátky jsou lepší, DNA je uvolněná
PROMOTOR: - -10 Pribnowův box
- -35 konsensus sekvence
- RNA pol. v komplexu se σ faktorem nasedá na -35 a posouvá se k -10 oblasti -> INICIAČNÍ BUBLINA
- vazebná místa pro TFs
Elongace transkripce bakterií
- vznik ternálního komplexu
- syntéza 40-60 bází/s
- syntéza 9 bází -> uvolnění σ faktoru a vazba dalších faktorů (NusA, NusB, NusC) a uvolnění z míst předčasného zastavení (GreA, GreB) -> do uvolnění σ faktoru tzv. abortivní iniciace
- Abortivní iniciace transkripce = všechny RNA pol. jsou schopné syntézy malinkého množství nedokončené DNA i když transkripce ještě neběží (jako zahřátí motoru), vznik krátkých transkriptů
- NusA, NusB, Nusc = antiterminační faktory
- GreA, GreB = homolog TFIIS, proofreading aktivita
Abortivní iniciace transkripce u bakterií
- všechny RNA pol. jsou schopné syntézy malinkého množství nedokončené DNA i když transkripce ještě neběží (jako zahřátí motoru)
- vznik krátkých transkriptů
Terminace transkripce bakterií
- Vždy závislé na struktuře a sekvenci primárního transkriptu
ρ-ZÁVISLÁ TERMINACE: - krátká oblast bohatá na C
- ATPázová aktivita ρ faktoru - interakce s NusA, NusG a RNA pol.
- ρ faktor se váže na sekvenci při výstupu z RNA pol. -> ATPázová aktivita -> vytáhne mRNA ven
- pokud je ssRNA rychle syntetizovaná a obsazená ribosomy, nemá se ρ faktor kam vázat
- polární efekt mutací, nonsense mutace odhalí místo pro vazbu ρ faktoru
ρ-NEZÁVISLÁ TERMINACE: - krátká repetice bohatá na CG páry, za ní polyU ocásek
- CG páry tvoří vlásenku
- PolyU oblast je méně stabilní -> vytáhnutí ven
Obrat RNA v buňce
= ,,turnover’’
- rRNA = 70~80 % celkové RNA v buňce
- tRNA = 15 %
- rRNA+tRNA = stabilizace modifikacemi, terciální strukturou, asociací s proteiny
- mRNA = 3-4 % - nestabilní, degradace hl. exonukleázami
Eukaryotní transkripce - RNA pol. + Transkripční faktory
- introny
- monocistronní transkripty
- delší poločas rozpadu
RNA pol. I: - syntéza rRNA v jadérku
- není citlivá k α-amanitinu
RNA pol. II: - syntéza mRNA
- je citlivá k α-amanitinu
- potřeba ATP pro iniciaci
- katalytické jádro je homologní k 2αββ’ prokaryoty
- většinou je RNA která je syntetizovaná RNA pol. II označená 5’mG čepičkou
RNA pol. III: - syntéza tRNA
- částečně citlivá k α-amanitinu
TRANSKRIPČNÍ FAKTORY: - role v iniciaci transkripce
- rozpoznávají promotor (označený aktivátory/represory nebo modifikacemi chromatinu)
- sestavují pre-iniciační a iniciační komplex RNA pol.
- speciální TFs - jen v určité tkáni, nebo jsou reakcí na vnější/vnitřní podněty
Housekeeping geny
= provozní geny
- udržení základní buněčné funkce
CTD
- = Karboxy-terminální doména
- nese ji RNA pol. II
- mnohonásobná repetice YSPTSPS, pod 10 opakování je to už neslučitelné se životem
- Fosforylované AMK mají (-) náboj
- esenciální pro život buňky
- díky prolinům jsou možné modifikace
- na počátku transkripce je na CTP málo fosforylovaný Ser2, ale více Ser5
- u syntézy polyA konce je naopak více fosforylovaný Ser2
Transkripce RNA pol. I (Eukaryota) - promotor
- velká pre-rRNA -> rozstříhaná na malé rRNA
- masivní produkce rRNA, bazén ribosomů je stále doplňován
PROMOTOR: - 2 h. konsensus oblasti
- -45 až +20 = Základní oblast pro zahájení transkripce
- -180 až -107 = Regulační oblast (UCE, ,,upstream control element’’)
- bohatý na GC páry, z 85 % identické
- UBF1 - poznává obě oblasti a váže se na ně
- SL1 = TBP, váže se na UBF1
Transkripce RNA pol. III - promotor, TFs
- 2 základní druhy promotorů:
- 1.Promotor pro 5S RNA (BoxA a BoxC) a tRNA (BoxA a BoxB), kompaktnější
- 2.Promotor pro snRNA
- TFIIIA = rozezná BoxA (promotor pro 5S rRNA)
- TFIIIB = TBP, déle navázán na promotor -> více cyklů RNA pol. III
- TFIIIC = umožňuje TFIIIB nasednout, rozezná BoxB
- promotor pro tRNA potřebuje vždy TFIIIB a TFIIIC
- promotor pro 5S rRNA navíc i TFIIIA
- Polyténní chromosomy = různé stavy RNA pol. II podle fosforylace CTD
Jak člověk odhalí promotor?
- Vezmu plasmid -> vložím reportér (např. GFP), pokud se produkuje -> došlo k transkripci
- Před reportér vložím neznámou oblast -> pokud dochází k produkci, vložili jsme promotor
Transkripce RNA pol. II - promotor, TFs, regulace
PROMOTOR:
- Oblast startu = Inr (Initiator), geny bez Inr mají často alternativní 5’ čepičku na mRNA
- cca -25 oblast = TATA box, často ohraničeno CG oblastí, (vazba TBP + TAF)
- cca -35 oblast = BRE element (vazba TBP)
- cca -75 oblast = CAAT box
- cca -90 oblast = GC box (vazba SP1 faktoru)
- cca -120 oblast = promotorové proximální oblasti
- Enhancery = promotorové distální oblasti
TRANSKRIPČNÍ FAKTORY:
- TFIID = TBP, interakce s TFIIB
- TFIIF = váže RNA pol. II
- TFIIH = oprava mutací Nucleotide excision repair, fosforylace CTD RNA pol. II
- TFIIE = nasednutí a aktivita u TFIIH
- Mediátorový komplex = další TFs
- TBP = součást TFs u všech eukaryotních RNA pol., vazba do malého žlábku, ohýbá DNA
- TFIIA = stabilizuje komplex DNA+TFIID+TBP
- TFIIS = homolog bakteriálních GreA, GreB
- PTFB = jeho součástí je Cdk9 (fosforylace na Ser2 a Ser5)
- CPSF a CSTF = štěpení a rozpoznání polyA signálu na mRNA
REGULACE:
- Metazoa = RNA pol. II zůstává stát na templátu cca 50 nukleotidů, výměna TFs a vazba elongačních faktorů
- RNA pol. II se zastaví po cca 100 nukleotidech = negativní regulátory DSIF a NELF, faktor PFB je fosforylací uvolní
Terminace transkripce u Eukaryot
RNA pol. I:
- končí na terminátorové sekvenci
- vyžaduje pomocný faktor - trochu funkčně připomíná prokaryotický σ faktor, ale tenhle se váže na DNA
- rozpoznání sekvence -> vazba faktoru -> zastavení RNA pol. I komplexu
RNA pol. II:
- 2 nezávislé oblasti ukončení
- 1.Ukončení vlastního transkriptu - v daném místě, pozná polyA signál
- 2.Vlastní ukončení transkripce - ustřihnutí transkriptu -> postupná signalizace na CTP -> defosforylace CTD, zastavení RNA pol. II
RNA pol. III:
- připomíná ρ-nezávislou terminaci
- vlásenkovité struktury
Polyadenylace
- 3’ konec je generován štěpením hnRNA (CFI, CFII, CstF = Cleavage Stimulating Factor) za polyA signálem
- za polyA signálem je U bohatá oblast - rozpozná CPSF a PAP polyadenyluje
- CPSF = Cleavage and Polyadenylation Specifity Factor
- PAP = PolyA polyadenyláza
- délka polyA ocásku určuje stabilitu, jak dobře se mRNA bude překládat a chrání před degradací
rozpoznání místa polyadenylace - CFI, CFII, CPSF, CstF
Transkripce u Archea
- 1 RNA pol.
- TF homologní s eTFIIB
- TBP se vážou na AT bohatou oblast promotoru
- Většinou polycistronní
- Iniciace: vazba TBP na TATA box -> vazba TBP -> interakce s BRE -> vazba RNA pol.
PROMOTOR: - -35 BRE
- -25 TATA box
- +1 Inr
