Transfert de gène Flashcards
protéines recombinantes
protéines produites par des cellules dont le contenu génétique a été modifié
production de protéine préférable
production par génie génétique
problèmes liés à l’utilisation d’hormone de croissance humaine
extraite à partir d’hypophyse de cadavres (contamination par le prion : Creuzfeld-Jacob)
problèmes liés à l’utilisation d’insuline de porc
un AA de plus que l’homme : réaction antigénique
problèmes liés à l’utilisation de FSH humaine
prélèvement d’urine de femmes ménopausées
synthèse de protéines recombinante : transcription d’un …
ADNc (complémentaire)
technique de sous-clonage
insertion du gène dans un vecteur
exemples de vecteurs pour le sous-clonage
plasmide, adénovirus inactivé
vecteur d’expression
transporteur génétique du gène d’intérêt codant pour la protéine recherchée
étapes du processus biotechnologique
(vecteur + cellule hôte) production séparation extraction purification
utilisation d’hôtes procaryotes
pas de modifications post traductionnelles (glycolysation)
utilisation d’hôtes eucaryotes
production de petits peptides (insuline)
utilisation de cellules CHO (ovaires de hamster chinois) comme hôtes
production de protéines complexes (poids moléculaire élevé)
utilisation de plantes comme hôtes
production de molécules à effet thérapeutique (ex : tabac)
utilisation d’animaux transgéniques comme hôtes
gène inséré en aval de la caséine : molécule sécrétée dans le lait
(investissements lourds et marchés très restreints)
banques cellulaires
congelées (décongelées lors de besoin de production)
objectifs des thérapies géniques
addition d’un gène exogène :
- restauration d’une fonction perdue
- invalidation d’un gène
- acquisition d’une nouvelle fonction cellulaire
transgenèse directe
micro-injection dans un ovocyte fécondé
caractéristiques de la transgenèse directe
délicat
intégration au hasard
rentabilité faible
éléments utilisés losr du ciblage génétique par recombinaison homologue
- enzyme de recombinaison (recombinase : CRE)
- séquences flanquantes connues
- cassette de sélection
caractéristique du ciblage génétique par recombinaison homologue
remplacement ou insertion contrôlée
comparaison du ciblage génétique (recombinaison) à la transgenèse directe
le ciblage génétique par recombinaison homologue est plus efficace que la transgenèse directe
knock-in
apport d’un gène
expression ou surexpression
knock-out
altération d’un gène
absence d’expression
préparation de cellules ES à partir de …
la masse cellulaire interne (embryon de la même espèce)
préparation de souris transgéniques à partir de cellules ES
préparation de cellules ES
insertion ADN (vecteur)
sélection des cellules recombinées (gène de sélection)
injection dans un blastocyte
souris mosaïque/chimérique
génération suivante : souris transgénique
pour des souris transgéniques il faut que le …
transgène soit intégrés aux gamètes
thérapie génique in vivo
injection directe du transgène
problèmes de la thérapie génique in vivo
accessibilité du tissu à traiter
nature du vecteur (utilisation de vecteurs viraux)
thérapie génique ex vivo
greffe de cellules génétiquement modifiées
cellules souches pluripotentes induites (IPS)
cellules adultes ramenées à l’état de cellules souches embryonnaires indifférenciées par injection de gène précis à l’aide de virus
exemple de cellules transformées en IPS
globules rouge
ARN interférents
petis ARN (ARNsi/ARNmi) susceptibles d’inhiber ou détruire spécifiquement un ARN cible
le siRNA est …
complémentaire de l’ARNm
interférence ARN
“post-transcriptional gene silencing”
pri-microARN
repliement du précurseur du microARN
longue épingle à cheveux : 1 000 nt
pré-microARN
pri-microARN coupé par Drosha
courte épingle à cheveux : 100 nt
Drosha
endonucléase du nucléoplasme
exportine-5
exporte le pré-microARN dans le cytoplasme
Dicer
endonucléase du cytoplasme
transforme le pré-microARN en miARN sb
complexeRISC
protéine argonaute + ARNmi
obstacles à l’utilisation d’ARN interférents (knock-down)
franchir les membranes cellulaires pour atteindre les cellules cibles
absence de toxicité
estimer leur stabilité et les doses à administrer
s’assurer de leur spécificité
utilisation des ARN interférent en thérapie humaine
pathologies tumorales
dégénérescence maculaire
utilisation des ARN interférent contre les pathologies tumorales
inhibition des EGFR (récepteur de facteur de croissance )
utilisation des ARN interférent contre la dégénérescence maculaire
inhibition des VeGF
bioinformatique
banque de données de séquences (AN, protéines)
banques de maladies (Orphanet)
application du transfert de gène au mammouth
fécondation à partir de sperme congelé de mammouth
clonage reproductif à partir d’une cellule congelée
clonage à partir du séquençage du génome du mammouth
