TIC : IMAGERIE CELLULAIRE Flashcards
Définition de la cellule
Unité fondamentale de la vie. C’est la plus petite quantité de matière vivante capable de subsister à l’état autonome et de se reproduire par division.
Quels sont les 5 tissus fondamentaux ? Que permet leur étude ?
Epithélium de revêtement et épithélium glandulaires
Tissus conjonctifs et squelettiques
Tissus nerveux
Tissus musculaires
Cellules sanguines et tissus hématopoïétiques
Leur étude permet l’histologie générale
Quels sont les organes, appareils et systèmes créés par l’association des tissus fondamentaux ?
Appareil cardio-vasculaire Appareil digestif Appareil respiratoire Appareil reproductif Appareil urinaire Appareil tégumentaire Système endocrinien Système immunitaire Organes des sens SNP et SNC
Quelle est la taille d’une cellule ?
Peut-elle être visible à l’œil nu
Taille cellule : 5-20 microns
Une cellule n’est jamais visible à l’œil nu même s’il est très grande (exemple : neurones)
Quelles sont les techniques d’imagerie cellulaire ?
Microscopie : observation avec ou sans analyse d’images
Cytométrie : mesure à échelon cellulaire ou supra-cellulaire
Définition du pouvoir séparateur / résolution
C’est la plus petite distance entre deux points vus séparément. Elle dépend de l’outil utilisé.
Plus la résolution est grande, plus la distance entre les 2 points est petite.
Chiffres résolution
Œil : 0.2 mm/200 microns
MO : 0,2 microns/200 ne
ME : 0.2 nm
Quelles sont les grandes étapes de l’imagerie cellulaire ?
Description morphologique des bio structures
Caractérisation et localisation des constituants biochimique in situ
Analyse moléculaire in situ
Approches quantitatives
Quelles sont les différences entre MO et ME ?
MO : photons
ME : électrons (lambda plus faible donc meilleure résolution)
(caractérisation et localisation des constituants biochimique in situ)
Définition histochimie et histoenzymologie
Histochimie : réactions chimiques sur la préparation histologique
Histoenzymologie : réactions enzymatiques sur préparation histologique (donc cellule vivante)
(Analyse moléculaire in situ)
Définition immunohistologie et but hybridation in situ
Immunohistologie : réactions immunologiques (Ac spé d’un Ag) sur préparation histologique
Hybridation in situ : sondes nucléiques pour explorer acides nucléiques
Approches quantitatives : quelles sont les méthodes ?
Cytométrie en flux et microscopie confocale
Quelles sont les cellules issues d’un prélèvement biologique ?
Liquide biologique
Liquide d’exploration
Liquide pathologique
Comment récupérer les cellules issues d’un prélèvement biologique ?
Écouvillonage nasopharyngé
Écouvillonage cervico-vaginal
Brossage bronchique
Puis analyse
Quelles sont les types de cellules vivantes ?
Cellules ex-vivo : fragments d’organes/ tissus (ex plant de peau humaine) + cellules dissociées, plus capables de se diviser et haut niveau de différenciation (neurone)
Cellules in-Vitro : cellules encore capables de se diviser
Qu’est-ce que la culture cellulaire et dans quel cas peut-on l’utiliser ?
Culture cellulaire : ensemble de techniques permettant de faire croître des cellules en dehors de leur organisme
Utilisation possible seulement avec des cellules in-vitro
Quelles sont les techniques de la culture cellulaire ?
Cellules en culture primaire
Cellules en culture secondaire
Lignées de cellules
Sphéroïdes
Qu’est-ce que la préparation à plat et quand peut-on recourir à cette méthode ?
Préparation à plat : observation d’une structure (ex capillaire sanguin) au microscope optique sans préparation préalable.
Seulement possible que la structure est très fine
Qu’est-ce que la coupe histologique et quand y-a-t-on recours?
Elle permet d’observer l’organisation histologique.
Utilisation : pour organes épais ou tumeurs épaisses
MO : possible, coupe fine
ME : possible, coupe ultra fine
De quoi est composée la partie optique du microscopique à fond clair (MO) ?
- condensateur (focalise faisceau)
- oculaire (agrandit image)
- objectif (concentre faisceau sur œil)
De quoi est composée la partie mécanique d’un MO ?
- potence (balance + poignée)
- tube optique
- platine
Quel est le fonctionnement d’un MO ?
- source d’éclairage = lumière blanche = photons
- condensateur focalise le faisceau sur la préparation = Max d’éclairage dessus
- objectif : lentille convergente génère image projetée au niveau du plan focal de la 2eme lentille => image réelle, agrandie et inversée
- oculaire transforme image en image virtuelle, droite et agrandie
Agrandissement
Atot = Aobjectif x Aoculaire
Que dire de la qualité d’image ?
Indépendante de l’oculaire et objectif mais dépend de la résolution et de l’agrandissement
Préparation pour étude cytologique sur cellule vivante
Coloration vitale : n’altère ni le fonctionnement de la cellule, ne la tue pas (pas tout de suite)
Rouge neutre (vacuole cytoplasmique) Bleu de Crésyl : ARNr, réticulocyte (diagnostic d’anémie)
Quelles sont les étapes de l’étude sur cellule “fixées” ?
- étalement/apposition
- fixation
- coloration
- observation
Étalement
-Par centrifugation :
Liquide très fluide ou peu riche en cellules (LCR, urine, épanchement séreux)
Projection de cellules en suspension sur une lame de verre
-Par frottis
Liquide semi-fluide (sérosité cervico-vaginal)
Avec forte densité cellulaire (sang, moelle osseuse)
Étalement sur lame de verre à partir du dispositif de prélèvement (écouvillons, brosse) ou 2e lame
Apposition/Empreinte
Échantillon solide (organes,tumeurs)
Exemple : ganglion lymphatique sentinelle
Fixation
Préserve les structures biologiques: image instanstanée à un moment donné que la cellule soit morte ou non
Insolubilisation des composants cellulaires
Préserve localisation spatiale
Prévient l’autolyse cellulaire
Fixation physique ~~
Séchage/congélation
Liquide fluide et peu de cellules
Prélèvement hématologique
—> séchage air libre
Fixation chimique
Fixateur en milieu liquide
Semi liquide (mucus) —> fixation par agent fixateur (vaporisation/immersion)
Coloration
- May-Grumwald-Giemsa : cellule sanguine
- Papanicolaou : met en évidence différents états de différenciation cellulaire
Quelles sont les étapes pour préparation pour échantillon épais ?
Fixation Inclusion Coupe Coloration Montage
Coupe histologique : fixation
Le plus rapidement possible après biopsie ou exérèse et immersion dans un grand volume de fixateur.
Quels sont les fixateurs pour une coupe histologique ?
acide acétique + méthanol
paraformaldéhyde (toxique +)
liquide de Bouin (formol + acide picrique) (fluo)
Coupe histologique : inclusion
- durcir l’échantillon : polymère capable
- paraffine mais pas miscible avec l’eau donc déshydratation -> bains d’alcool croissants puis solvant de la paraffine = toluène puis paraffine fondue (56°C)
- Pb : certains éléments comme les protéines sont sensibles la chaleur
- utilisation de résines en plastique (30-37°C) ou congélation à l’azote
- préserve bio structures et activités enzymatiques mais utilisation de cru-protecteurs pour éviter cristaux de glace qui pourraient altérer le fonctionnement puis azote liquide (-180°C)
Coupe histologique : coupe
- utilisation d’un microtome pourvu d’une avancée mécanique et d’un couteau d’acier
- coupe fine : 2-5 microns
- déposées et collées sur lame de verre
- coupe en congélation avec un cryostat à -20, -30°C (ne pas faire fondre échantillon)
Coupe histologique : coloration
- but : augmenter contraster et faire apparaître différents composants
- se fait après déparaffinage (chaleur et bain de Toluène) et réhydratation (bains d’alcool décroissants puis eau distillée) car colorants hydrophiles
- 100aine de colorants
Quelles sont les trois colorations les plus utilisées en coupe histologique ?
- Hématéine Eosine : colore noyaux en violet car H colorant basique donc affinité avec l’ADN acide et colore le cytoplasme en rose car E colorant acide donc affinité avec protéines basiques
- Hématéine Eosine Safran : colore le collagène en jaune
- Trichrome de Masson : Fuschine acide colore le cytoplasme en rose/rouge, le vert lumière colore collagène en bleu/vert et hématoxyciline colore noyau en brun.
Coupe histologique : montage
- après coloration puis déshydratation
- entre lame et lamelle
- avec milieu de montage indice de réfraction doit être proche pour ne pas avoir d’aberration optique
Qu’est-ce qu’un microscope optique à contraste de phase ?
MO standard avec un module de contraste de phase. Il met en évidence les différences d’indices de réfraction en révélant les différences de phase
Comment fonctionne un MOCP ?
- lumière : onde lumineuse de déphasage
- système de prisme (amplifie contrastes et les rend perceptibles à l’oeil)
- condensateur et objectif modifié
MOCP : étude
cellule vivante et préparations non colorées
Microscope à fluorescence : fonctionnement de base
- fluorochromes : substances qui excitées émettent une lumière dont lambda est inférieure à celle de l’émission
- filtres pour sélectionner les lambdas
- miroir dichroïque réfléchit une longueur d’onde et en laisse passer une autre
- marqueur (présence) et sonde (envt) fluorescents
MET : fonctionnement
- rayonnement : filament de tungstène (W, Z=74) (e-)
- lentilles = solénoïdes : champ électromag + concentre e-
- recueil des e- ayant traversé préparation
- fonctionnement sous vide
- résolution : 0,2 nm
- caméras et appareils photos numériques pour obtenir capture image
MET par rapport MO
- image en noir et blanc
- meilleure résolution
Préparation fixation MET
- glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate (phosphate)
- post fixation : acide osmique (OsO4)
Préparation inclusion MET
- déshydratation dans les bains d’alcool de degré croissant puis d’oxyde de propylène (solvant des résines synthétiques)
- résines synthétiques : éponge ou araldite (plus solides paraffine)
Préparation coupe MET
ultrafine : 50-100 nm
ultramicrotome : avance thermique par dilatation
couteau en diamant +++ ou verre
déposées sur grilles de cuivre quadrillées
coloration met
acétate uranyle
citrate de plomb
MEB fonctionnement
même fonctionnement que le met mais pas de recueil des e- traversants
image pas en 3D
déflecteurs d’e- = véritable balayage sur préparation
MEB préparation fixation
glutaraldéhyde dans un tampon de Cacodylate (ou phosphate)
pas de post fixation
Etapes de préparation du MEB
fixation
déshydratation très poussée
métallisation
attention pas de coupe, coloration ou inclusion
déshydratation très poussée meb
bains d’alcool de degré croissant puis CO2 liquide
passage au point critique du CO2 (32°C)
passage état liquide à gazeux entraîne dessiccation par lyophilisation
métallisation meb
dépôt d’une fiche couche d’or palladium (2-10 nm) pour réflexion des électrons
Qu’est-ce que l’histochimie ?
déceler et localiser les substances organiques et minérales : surtout les constituants biochimiques (lipides, glucides et protides) à partir de réactions chimiques mettant en évidence des fonctions/groupements chimiques
Quels sont les exemples d’histochimie ? (1)
-glucide et réaction à l’acide périodique (PAS)
mettre en évidence présence glucides et glycols comme dans les macromolécules : glycogène, mucine et glycolipides ; acide périodique oxyde groupements glycols ->devient aldéhyde mis en évidence par réaction de schiff (coloration rouge pourpre)
Quels sont les exemples d’histochimie ? (2)
-ADN et réaction de Feulgen-Rossenbeck
but : marquer ADN
hydrolyse de l’ADN par DNAse -> f° aldéhyde mise en évidence du désoxyribose
aldéhyde révélés par réaction de schiff (rouge pourpre)
Qu’est-ce que l’histoenzymologie ?
déceler et localiser réactions enzymatiques (pas enzyme même) en mettant en évidence leur action enzymatique sur un substrat spécifique de l’enzyme
Sur quels types d’échantillons peut-on faire l’histoenzymologie ?
- cellule vivantes
- coupes histoenzymologiques de congélation avec conservation de l’activité enzymologie (attention conditions optimales car histoenzymologie ne marche pas à froid)
Exemple 1 d’histoenzymologie
Activité des peroxydases
peroxydase + eau oxydée oxyde diaminobenzidine (DAB) -> précipité noir
Exemple 2 d’histoenzymologie
Activité ATPasique des CMstsg
chlorure de cobalt + ATPase -> phosphate de cobalt + sulfure d’ammonium -> sulfure de cobalt (précipité brun)
Qu’est-ce que l’immunohistologie ?
détecter et localiser Ag
Ag = protéine/polyoside
Ac spé et Ag -> complexe immun
Quelles sont les différentes techniques pour l’immunohistologie ?
- fluorochrome (mf, mconf, cmf)
- enzyme (mofc)
- or colloïdal (me)
Quelles sont les enzymes utilisées en immunohistologie ?
enzymes exogènes apportées donc les techniques de révélation sont indépendantes des enzymes dans les cellules : on peut fixer la cellule
Quelles sont les étapes de l’immunohistologie ?
- révélation indirecte- ou directe-
- marquage direct : ac lié à une enzyme/fluorochrome/or colloïdal
- marquage indirect :
- Ac 1aire dirigé contre Ag d’une autre espèce puis Ac 2ndaire couplé flou/enzyme/ or colloïdal dirigé contre le 1er
- biotine dirigée contre Ag et Avidine/Streptavidine marqué et dirigé contre 1er Ac
- Digoxigénine dirigée contre Ag puis un 2ème anti-digoxigénine marqué dirigé contre 1er
Qu’est-ce que l’hybridation in situ ?
utilisation de sondes nucléiques marquées complémentaires pour détecter et localiser dans des cellules ou tissus une séquence spécifique ADN ou ARN
permet l’étude des gènes et de leur expression
Quelles sont les étapes de l’hybridation in situ ?
- dénaturation du brin d’ADN et de la sonde : devient un mono brin en chauffant (90-95°C)
- retour à 37°C : ADN redevient double hélice et la sonde d’hybride Avec leurs séquences complémentaires sur leur cible
- lecture selon le marqueur
quels sont les marqueurs de l’hybridation in situ ?
- isotopes radioactifs quand sondes chaudes donc au début de l’hybridation (arrêt car danger pour santé)
- sondes frondes non radioactives (fluorochrome eg) :FISH et M-FISH
- enzymes (phosphate alcaline, peroxydase)
- biotine, digoxygénine
- or colloïdal
Exemple 1 de l’hybridation in situ ?
Amniocytes = étude cytogénétique
utilisation de sondes spécifiques (FISH) pour détecter trisomie 13, 18, 21 chez le foetus
Exemple 2 de l’hybridation in situ ?
Sondes couplées à l’ARN
on s’intéresse à l’expression d’un ou des gènes particuliers et on observe au niveau des différences cellulaires où le gène d’intérêt s’exprime
Qu’est-ce qu’une approche quantitative ?
technique qui permet une analyse quantitative à l’échelon cellulaire ou subcellulaire
Quelles sont les techniques de l’approche quantitative ?
cytométrie en flux
microscopie confocale
Quel est l’intérêt de la cytométrie en flux ?
compter les cellules, tri physique et caractérisation la cellule
Quels types d’échantillons pour la cytométrie en flux ?
-cellules monodispersées et en suspension
-monodispersion physiologique
-monodispersion physique (dissection)
-cellule fluorescente
-cellule vivante/fixée
PAS DE TISSU
Quels sont les quatre systèmes de la CEF ?
système fluidique
système optique
système électrique
système informatique
Système fluidique de la CEF
les cellules sont injectées dans un tube où se trouve un liquide de gaine. Il y a une différence de pression entre le liquide et la gaine. Quand les cellules sont à proximité, aspirées dans flux de grande vitesse (sont au centre et à la queue le-le) et passent une à une devant un faisceau d’analyse puis devant un vibrateur : 1 micro-goutte pour 1 cellule
Système optique de la CEF
source : laser
lentille (concentre faisceau)
filtres et miroirs dichroïques : gèrent les longueurs d’ondes
Système électrique CEF
transforme signaux lumineux en signaux électriques
Système informatique CEF
histogramme : 1 paramètre étudié
cytogramme : 2 paramètres étudiés
Quelles informations sur la cellule a-t-on avec la CEF ?
lumière donne infos/caractéristiques morphologiques des cellules
- lumière dans l’axe du laser : ombre des cellules -> proportionnelle taille cellules
- lumière à 90° de l’axe du laser : données sur granularité, rapport nucléocytoplasmique et complexité intracytoplasmique
- lumière fluorescente : comportement/ fonctionnement cellule
Quelles sont les applications de la CEF ?
- phénotypage des LT (LTCD3, 4, 8 CD ; cluster de différenciation = Ag surface)
- contenance en ADN dans la cellule et cycle cellulaire (phase du cycle ; cancérisation)
Qu’est-ce que la microscopie convocable ?
méthode cytologique et histologique analytique : reconstruction 3D du centre d’intérêt
cellules vivantes : études fonctionnelles
Quels types d’échantillons pour la microscopie confocale ?
- cellules adhérentes, fixées, vivantes
- histologie : coupe histologique/à congélation
- tissus/cellules marquées par fluorescence (marqueurs couplés Ac/sondes nucléiques, marqueurs spés, sondes fluorescentes)
Quel est le fonctionnement du MCF ?
source : laser
pinhole : diaphragme devant détecteur = ne laisse passer que le flux lumineux du plan focal
platine : balayage en z + déplacement du plan focal pour reconstruction 3D
intervalle entre plans focaux
Quelles applications pour MCF ?
localisation et colocalisation tissulaire et cellulaire
eg : organe de corti et territoire Komique
Quelles sont les cellules utilisées pour les études cellulaires ?
cellules in vitro (cellules proliférantes)
cellules ex vivo (cellules non proliférantes) : culture monocouche ou cellulaire (3D)
Principe de l’étude sur modèle cellulaire ?
expériences sur cultures (transfecter cellules avec gène muté, modifications conditions expérimentales etc…)
analyse fonctionnelle
analyse moléculaire
Qu’est-ce qu’un modèle cellulaire ?
matériel biologique vivant qui se rapproche au mieux des caractéristiques biologiques et fonctionnelles des cellules d’intérêt (sérum physiologique ou pathologique)
Modèle cellulaire : la culture primaire et secondaire
dérive directement d’un organe/tissu
cellules proliférantes n’ont plus de place à un moment, elles adhérent et rentrent en contact : pb = confluence de cellules
repiquage division par dilution
changement de support : resemencées -> culture secondaire
modèle cellulaire très proche des cellules in vitro mais limité temporellement car nb de divisions limité, arrêt du cycle cellulaire alors que cellule toujours vivante donc apoptose
Modèle cellulaire : lignées de cellules
cellules immortalisées donc pas de pb de divisions
- acquises spontanément (physio ou pathos =cancers) ex : cellules HeLa (Henriette Lack)
- induites par des oncogènes
- pas représentatives de vraies tumeurs : + de cellules + MEC + hypoxie intra tumorale
Modèle cellulaire : sphéroïdes
agrégat de cellules (100-400nm) à partir de lignées tumorales croissance en 3D et en suspension support non adhérent cellules en suspension dans un gel de protéines de MEC solubilisée milieu de culture : agitation douce cellule en contact = sphéroïdes interaction cellule-cellule et cellule-MEC gradient décroissant d'O2
Culture en 2D, culture cellulaire
monocouche pr cellules adhérentes
en suspension dans liquide
support : flasque, plaque w/ puits, boite de pétri
culture cellulaire : le milieu de culture
riche en ions facteurs de croissance (AA essentiels et vitamines) glucose serum veau foetal tampon CO2, hydrogénocarboné
culture cellulaire : conditions de culture
37°C stérile sous hotte \+/- 5% de CO2 (pas besoin si 1-2 j) enceinte humide (85%) surveillance MOCP
Test de viabilité def
évaluer proportion de cellules mortes/vivantes dans culture
Test de viabilité : technique pour marquer cellules vivantes
Fluorochromes avec Calcéine AM : substrat de l’estérase et seules les cellules vivantes ont de l’estérase fonctionnelles : marque en VERT
Test de viabilité : technique pour marquer cellules mortes
Bleu de trépan : rentre dans toutes les cellules mais les vivantes l’éjectent donc marque les mortes
Fluorochromes avec iodure de propidium qui marque ADN quand membrane perméable, le cas quand cellules mortes ROUGE
Qu’est-ce que la greffe cellulaire ?
restaurer les fonctions des organes/tissus altérés par accident/pathologie
Greffe autologue/allogénique
- autologue : même donneur et receveur
- allogénique : donneur et receveur différents
Quels outils pour étude des cellules souches ?
CS adultes
CS embryonnaires humaines
C iPs
Caractéristiques cellules souches
cellules indifférenciées : très immatures
non reconnues par aspect morphologique
capacité d’auto-renouvellement (maintien réserve)
capacité de différenciation (acquisition caract morphologiques pour assurer f° spécifique)
capacité de division asymétrique
Quels sont les types de cellules souches ?
totipotente (orna entier, oeuf au stade pré-compaction)
pluripotente (Mcl morula, blastocyste + cellules issues des 3 feuillets et CS germinales)
multipotente (un seuil feuillet embryonnaire)
unipotente (lignée de cellules)
Quelles sont les CS à intérêt thérapeutique ?
CsEH (FIV)
CS multipotentes (foetales et adultes)
CS adultes
