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Histologie > TIC : IMAGERIE CELLULAIRE > Flashcards

TIC : IMAGERIE CELLULAIRE Flashcards

1
Q

Définition de la cellule

A

Unité fondamentale de la vie. C’est la plus petite quantité de matière vivante capable de subsister à l’état autonome et de se reproduire par division.

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2
Q

Quels sont les 5 tissus fondamentaux ? Que permet leur étude ?

A

Epithélium de revêtement et épithélium glandulaires
Tissus conjonctifs et squelettiques
Tissus nerveux
Tissus musculaires
Cellules sanguines et tissus hématopoïétiques

Leur étude permet l’histologie générale

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3
Q

Quels sont les organes, appareils et systèmes créés par l’association des tissus fondamentaux ?

A 
Appareil cardio-vasculaire
Appareil digestif
Appareil respiratoire 
Appareil reproductif 
Appareil urinaire
Appareil tégumentaire
Système endocrinien
Système immunitaire 
Organes des sens
SNP et SNC
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4
Q

Quelle est la taille d’une cellule ?

Peut-elle être visible à l’œil nu

A

Taille cellule : 5-20 microns

Une cellule n’est jamais visible à l’œil nu même s’il est très grande (exemple : neurones)

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5
Q

Quelles sont les techniques d’imagerie cellulaire ?

A

Microscopie : observation avec ou sans analyse d’images

Cytométrie : mesure à échelon cellulaire ou supra-cellulaire

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6
Q

Définition du pouvoir séparateur / résolution

A

C’est la plus petite distance entre deux points vus séparément. Elle dépend de l’outil utilisé.
Plus la résolution est grande, plus la distance entre les 2 points est petite.

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7
Q

Chiffres résolution

A

Œil : 0.2 mm/200 microns
MO : 0,2 microns/200 ne
ME : 0.2 nm

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8
Q

Quelles sont les grandes étapes de l’imagerie cellulaire ?

A

Description morphologique des bio structures
Caractérisation et localisation des constituants biochimique in situ
Analyse moléculaire in situ
Approches quantitatives

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9
Q

Quelles sont les différences entre MO et ME ?

A

MO : photons

ME : électrons (lambda plus faible donc meilleure résolution)

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10
Q

(caractérisation et localisation des constituants biochimique in situ)

Définition histochimie et histoenzymologie

A

Histochimie : réactions chimiques sur la préparation histologique

Histoenzymologie : réactions enzymatiques sur préparation histologique (donc cellule vivante)

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11
Q

(Analyse moléculaire in situ)

Définition immunohistologie et but hybridation in situ

A

Immunohistologie : réactions immunologiques (Ac spé d’un Ag) sur préparation histologique

Hybridation in situ : sondes nucléiques pour explorer acides nucléiques

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12
Q

Approches quantitatives : quelles sont les méthodes ?

A

Cytométrie en flux et microscopie confocale

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13
Q

Quelles sont les cellules issues d’un prélèvement biologique ?

A

Liquide biologique
Liquide d’exploration
Liquide pathologique

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14
Q

Comment récupérer les cellules issues d’un prélèvement biologique ?

A

Écouvillonage nasopharyngé
Écouvillonage cervico-vaginal
Brossage bronchique

Puis analyse

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15
Q

Quelles sont les types de cellules vivantes ?

A

Cellules ex-vivo : fragments d’organes/ tissus (ex plant de peau humaine) + cellules dissociées, plus capables de se diviser et haut niveau de différenciation (neurone)
Cellules in-Vitro : cellules encore capables de se diviser

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16
Q

Qu’est-ce que la culture cellulaire et dans quel cas peut-on l’utiliser ?

A

Culture cellulaire : ensemble de techniques permettant de faire croître des cellules en dehors de leur organisme
Utilisation possible seulement avec des cellules in-vitro

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17
Q

Quelles sont les techniques de la culture cellulaire ?

A

Cellules en culture primaire
Cellules en culture secondaire
Lignées de cellules
Sphéroïdes

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18
Q

Qu’est-ce que la préparation à plat et quand peut-on recourir à cette méthode ?

A

Préparation à plat : observation d’une structure (ex capillaire sanguin) au microscope optique sans préparation préalable.
Seulement possible que la structure est très fine

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19
Q

Qu’est-ce que la coupe histologique et quand y-a-t-on recours?

A

Elle permet d’observer l’organisation histologique.
Utilisation : pour organes épais ou tumeurs épaisses
MO : possible, coupe fine
ME : possible, coupe ultra fine

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20
Q

De quoi est composée la partie optique du microscopique à fond clair (MO) ?

A
  • condensateur (focalise faisceau)
  • oculaire (agrandit image)
  • objectif (concentre faisceau sur œil)
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21
Q

De quoi est composée la partie mécanique d’un MO ?

A
  • potence (balance + poignée)
  • tube optique
  • platine
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22
Q

Quel est le fonctionnement d’un MO ?

A
  • source d’éclairage = lumière blanche = photons
  • condensateur focalise le faisceau sur la préparation = Max d’éclairage dessus
  • objectif : lentille convergente génère image projetée au niveau du plan focal de la 2eme lentille => image réelle, agrandie et inversée
  • oculaire transforme image en image virtuelle, droite et agrandie
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23
Q

Agrandissement

A

Atot = Aobjectif x Aoculaire

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24
Q

Que dire de la qualité d’image ?

A

Indépendante de l’oculaire et objectif mais dépend de la résolution et de l’agrandissement

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25
Q

Préparation pour étude cytologique sur cellule vivante

A

Coloration vitale : n’altère ni le fonctionnement de la cellule, ne la tue pas (pas tout de suite)

Rouge neutre (vacuole cytoplasmique)
Bleu de Crésyl : ARNr, réticulocyte (diagnostic d’anémie)
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26
Q

Quelles sont les étapes de l’étude sur cellule “fixées” ?

A
  • étalement/apposition
  • fixation
  • coloration
  • observation
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27
Q

Étalement

A

-Par centrifugation :
Liquide très fluide ou peu riche en cellules (LCR, urine, épanchement séreux)
Projection de cellules en suspension sur une lame de verre
-Par frottis
Liquide semi-fluide (sérosité cervico-vaginal)
Avec forte densité cellulaire (sang, moelle osseuse)
Étalement sur lame de verre à partir du dispositif de prélèvement (écouvillons, brosse) ou 2e lame

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28
Q

Apposition/Empreinte

A

Échantillon solide (organes,tumeurs)

Exemple : ganglion lymphatique sentinelle

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29
Q

Fixation

A

Préserve les structures biologiques: image instanstanée à un moment donné que la cellule soit morte ou non

Insolubilisation des composants cellulaires
Préserve localisation spatiale
Prévient l’autolyse cellulaire

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30
Q

Fixation physique ~~

A

Séchage/congélation

Liquide fluide et peu de cellules
Prélèvement hématologique
—> séchage air libre

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31
Q

Fixation chimique

A

Fixateur en milieu liquide

Semi liquide (mucus)
—> fixation par agent fixateur (vaporisation/immersion)
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32
Q

Coloration

A
  • May-Grumwald-Giemsa : cellule sanguine

- Papanicolaou : met en évidence différents états de différenciation cellulaire

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33
Q

Quelles sont les étapes pour préparation pour échantillon épais ?

A 
Fixation
Inclusion
Coupe
Coloration
Montage
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34
Q

Coupe histologique : fixation

A

Le plus rapidement possible après biopsie ou exérèse et immersion dans un grand volume de fixateur.

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35
Q

Quels sont les fixateurs pour une coupe histologique ?

A

acide acétique + méthanol
paraformaldéhyde (toxique +)
liquide de Bouin (formol + acide picrique) (fluo)

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36
Q

Coupe histologique : inclusion

A
  • durcir l’échantillon : polymère capable
  • paraffine mais pas miscible avec l’eau donc déshydratation -> bains d’alcool croissants puis solvant de la paraffine = toluène puis paraffine fondue (56°C)
  • Pb : certains éléments comme les protéines sont sensibles la chaleur
  • utilisation de résines en plastique (30-37°C) ou congélation à l’azote
  • préserve bio structures et activités enzymatiques mais utilisation de cru-protecteurs pour éviter cristaux de glace qui pourraient altérer le fonctionnement puis azote liquide (-180°C)
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37
Q

Coupe histologique : coupe

A
  • utilisation d’un microtome pourvu d’une avancée mécanique et d’un couteau d’acier
  • coupe fine : 2-5 microns
  • déposées et collées sur lame de verre
  • coupe en congélation avec un cryostat à -20, -30°C (ne pas faire fondre échantillon)
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38
Q

Coupe histologique : coloration

A
  • but : augmenter contraster et faire apparaître différents composants
  • se fait après déparaffinage (chaleur et bain de Toluène) et réhydratation (bains d’alcool décroissants puis eau distillée) car colorants hydrophiles
  • 100aine de colorants
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39
Q

Quelles sont les trois colorations les plus utilisées en coupe histologique ?

A
  • Hématéine Eosine : colore noyaux en violet car H colorant basique donc affinité avec l’ADN acide et colore le cytoplasme en rose car E colorant acide donc affinité avec protéines basiques
  • Hématéine Eosine Safran : colore le collagène en jaune
  • Trichrome de Masson : Fuschine acide colore le cytoplasme en rose/rouge, le vert lumière colore collagène en bleu/vert et hématoxyciline colore noyau en brun.
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40
Q

Coupe histologique : montage

A
  • après coloration puis déshydratation
  • entre lame et lamelle
  • avec milieu de montage indice de réfraction doit être proche pour ne pas avoir d’aberration optique
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41
Q

Qu’est-ce qu’un microscope optique à contraste de phase ?

A

MO standard avec un module de contraste de phase. Il met en évidence les différences d’indices de réfraction en révélant les différences de phase

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42
Q

Comment fonctionne un MOCP ?

A
  • lumière : onde lumineuse de déphasage
  • système de prisme (amplifie contrastes et les rend perceptibles à l’oeil)
  • condensateur et objectif modifié
43
Q

MOCP : étude

A

cellule vivante et préparations non colorées

44
Q

Microscope à fluorescence : fonctionnement de base

A
  • fluorochromes : substances qui excitées émettent une lumière dont lambda est inférieure à celle de l’émission
  • filtres pour sélectionner les lambdas
  • miroir dichroïque réfléchit une longueur d’onde et en laisse passer une autre
  • marqueur (présence) et sonde (envt) fluorescents
45
Q

MET : fonctionnement

A
  • rayonnement : filament de tungstène (W, Z=74) (e-)
  • lentilles = solénoïdes : champ électromag + concentre e-
  • recueil des e- ayant traversé préparation
  • fonctionnement sous vide
  • résolution : 0,2 nm
  • caméras et appareils photos numériques pour obtenir capture image
46
Q

MET par rapport MO

A
  • image en noir et blanc

- meilleure résolution

47
Q

Préparation fixation MET

A
  • glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate (phosphate)

- post fixation : acide osmique (OsO4)

48
Q

Préparation inclusion MET

A
  • déshydratation dans les bains d’alcool de degré croissant puis d’oxyde de propylène (solvant des résines synthétiques)
  • résines synthétiques : éponge ou araldite (plus solides paraffine)
49
Q

Préparation coupe MET

A

ultrafine : 50-100 nm
ultramicrotome : avance thermique par dilatation
couteau en diamant +++ ou verre
déposées sur grilles de cuivre quadrillées

50
Q

coloration met

A

acétate uranyle

citrate de plomb

51
Q

MEB fonctionnement

A

même fonctionnement que le met mais pas de recueil des e- traversants
image pas en 3D
déflecteurs d’e- = véritable balayage sur préparation

52
Q

MEB préparation fixation

A

glutaraldéhyde dans un tampon de Cacodylate (ou phosphate)

pas de post fixation

53
Q

Etapes de préparation du MEB

A

fixation
déshydratation très poussée
métallisation
attention pas de coupe, coloration ou inclusion

54
Q

déshydratation très poussée meb

A

bains d’alcool de degré croissant puis CO2 liquide
passage au point critique du CO2 (32°C)
passage état liquide à gazeux entraîne dessiccation par lyophilisation

55
Q

métallisation meb

A

dépôt d’une fiche couche d’or palladium (2-10 nm) pour réflexion des électrons

56
Q

Qu’est-ce que l’histochimie ?

A

déceler et localiser les substances organiques et minérales : surtout les constituants biochimiques (lipides, glucides et protides) à partir de réactions chimiques mettant en évidence des fonctions/groupements chimiques

57
Q

Quels sont les exemples d’histochimie ? (1)

A

-glucide et réaction à l’acide périodique (PAS)
mettre en évidence présence glucides et glycols comme dans les macromolécules : glycogène, mucine et glycolipides ; acide périodique oxyde groupements glycols ->devient aldéhyde mis en évidence par réaction de schiff (coloration rouge pourpre)

58
Q

Quels sont les exemples d’histochimie ? (2)

A

-ADN et réaction de Feulgen-Rossenbeck
but : marquer ADN
hydrolyse de l’ADN par DNAse -> f° aldéhyde mise en évidence du désoxyribose
aldéhyde révélés par réaction de schiff (rouge pourpre)

59
Q

Qu’est-ce que l’histoenzymologie ?

A

déceler et localiser réactions enzymatiques (pas enzyme même) en mettant en évidence leur action enzymatique sur un substrat spécifique de l’enzyme

60
Q

Sur quels types d’échantillons peut-on faire l’histoenzymologie ?

A
  • cellule vivantes
  • coupes histoenzymologiques de congélation avec conservation de l’activité enzymologie (attention conditions optimales car histoenzymologie ne marche pas à froid)
61
Q

Exemple 1 d’histoenzymologie

A

Activité des peroxydases

peroxydase + eau oxydée oxyde diaminobenzidine (DAB) -> précipité noir

62
Q

Exemple 2 d’histoenzymologie

A

Activité ATPasique des CMstsg

chlorure de cobalt + ATPase -> phosphate de cobalt + sulfure d’ammonium -> sulfure de cobalt (précipité brun)

63
Q

Qu’est-ce que l’immunohistologie ?

A

détecter et localiser Ag
Ag = protéine/polyoside
Ac spé et Ag -> complexe immun

64
Q

Quelles sont les différentes techniques pour l’immunohistologie ?

A
  • fluorochrome (mf, mconf, cmf)
  • enzyme (mofc)
  • or colloïdal (me)
65
Q

Quelles sont les enzymes utilisées en immunohistologie ?

A

enzymes exogènes apportées donc les techniques de révélation sont indépendantes des enzymes dans les cellules : on peut fixer la cellule

66
Q

Quelles sont les étapes de l’immunohistologie ?

A
  • révélation indirecte- ou directe-
  • marquage direct : ac lié à une enzyme/fluorochrome/or colloïdal
  • marquage indirect :
    • Ac 1aire dirigé contre Ag d’une autre espèce puis Ac 2ndaire couplé flou/enzyme/ or colloïdal dirigé contre le 1er
    • biotine dirigée contre Ag et Avidine/Streptavidine marqué et dirigé contre 1er Ac
    • Digoxigénine dirigée contre Ag puis un 2ème anti-digoxigénine marqué dirigé contre 1er
67
Q

Qu’est-ce que l’hybridation in situ ?

A

utilisation de sondes nucléiques marquées complémentaires pour détecter et localiser dans des cellules ou tissus une séquence spécifique ADN ou ARN
permet l’étude des gènes et de leur expression

68
Q

Quelles sont les étapes de l’hybridation in situ ?

A
  • dénaturation du brin d’ADN et de la sonde : devient un mono brin en chauffant (90-95°C)
  • retour à 37°C : ADN redevient double hélice et la sonde d’hybride Avec leurs séquences complémentaires sur leur cible
  • lecture selon le marqueur
69
Q

quels sont les marqueurs de l’hybridation in situ ?

A
  • isotopes radioactifs quand sondes chaudes donc au début de l’hybridation (arrêt car danger pour santé)
  • sondes frondes non radioactives (fluorochrome eg) :FISH et M-FISH
  • enzymes (phosphate alcaline, peroxydase)
  • biotine, digoxygénine
  • or colloïdal
70
Q

Exemple 1 de l’hybridation in situ ?

A

Amniocytes = étude cytogénétique

utilisation de sondes spécifiques (FISH) pour détecter trisomie 13, 18, 21 chez le foetus

71
Q

Exemple 2 de l’hybridation in situ ?

A

Sondes couplées à l’ARN
on s’intéresse à l’expression d’un ou des gènes particuliers et on observe au niveau des différences cellulaires où le gène d’intérêt s’exprime

72
Q

Qu’est-ce qu’une approche quantitative ?

A

technique qui permet une analyse quantitative à l’échelon cellulaire ou subcellulaire

73
Q

Quelles sont les techniques de l’approche quantitative ?

A

cytométrie en flux

microscopie confocale

74
Q

Quel est l’intérêt de la cytométrie en flux ?

A

compter les cellules, tri physique et caractérisation la cellule

75
Q

Quels types d’échantillons pour la cytométrie en flux ?

A

-cellules monodispersées et en suspension
-monodispersion physiologique
-monodispersion physique (dissection)
-cellule fluorescente
-cellule vivante/fixée
PAS DE TISSU

76
Q

Quels sont les quatre systèmes de la CEF ?

A

système fluidique
système optique
système électrique
système informatique

77
Q

Système fluidique de la CEF

A

les cellules sont injectées dans un tube où se trouve un liquide de gaine. Il y a une différence de pression entre le liquide et la gaine. Quand les cellules sont à proximité, aspirées dans flux de grande vitesse (sont au centre et à la queue le-le) et passent une à une devant un faisceau d’analyse puis devant un vibrateur : 1 micro-goutte pour 1 cellule

78
Q

Système optique de la CEF

A

source : laser
lentille (concentre faisceau)
filtres et miroirs dichroïques : gèrent les longueurs d’ondes

79
Q

Système électrique CEF

A

transforme signaux lumineux en signaux électriques

80
Q

Système informatique CEF

A

histogramme : 1 paramètre étudié

cytogramme : 2 paramètres étudiés

81
Q

Quelles informations sur la cellule a-t-on avec la CEF ?

A

lumière donne infos/caractéristiques morphologiques des cellules

  • lumière dans l’axe du laser : ombre des cellules -> proportionnelle taille cellules
  • lumière à 90° de l’axe du laser : données sur granularité, rapport nucléocytoplasmique et complexité intracytoplasmique
  • lumière fluorescente : comportement/ fonctionnement cellule
82
Q

Quelles sont les applications de la CEF ?

A
  • phénotypage des LT (LTCD3, 4, 8 CD ; cluster de différenciation = Ag surface)
  • contenance en ADN dans la cellule et cycle cellulaire (phase du cycle ; cancérisation)
83
Q

Qu’est-ce que la microscopie convocable ?

A

méthode cytologique et histologique analytique : reconstruction 3D du centre d’intérêt
cellules vivantes : études fonctionnelles

84
Q

Quels types d’échantillons pour la microscopie confocale ?

A
  • cellules adhérentes, fixées, vivantes
  • histologie : coupe histologique/à congélation
  • tissus/cellules marquées par fluorescence (marqueurs couplés Ac/sondes nucléiques, marqueurs spés, sondes fluorescentes)
85
Q

Quel est le fonctionnement du MCF ?

A

source : laser
pinhole : diaphragme devant détecteur = ne laisse passer que le flux lumineux du plan focal
platine : balayage en z + déplacement du plan focal pour reconstruction 3D
intervalle entre plans focaux

86
Q

Quelles applications pour MCF ?

A

localisation et colocalisation tissulaire et cellulaire

eg : organe de corti et territoire Komique

87
Q

Quelles sont les cellules utilisées pour les études cellulaires ?

A

cellules in vitro (cellules proliférantes)

cellules ex vivo (cellules non proliférantes) : culture monocouche ou cellulaire (3D)

88
Q

Principe de l’étude sur modèle cellulaire ?

A

expériences sur cultures (transfecter cellules avec gène muté, modifications conditions expérimentales etc…)
analyse fonctionnelle
analyse moléculaire

89
Q

Qu’est-ce qu’un modèle cellulaire ?

A

matériel biologique vivant qui se rapproche au mieux des caractéristiques biologiques et fonctionnelles des cellules d’intérêt (sérum physiologique ou pathologique)

90
Q

Modèle cellulaire : la culture primaire et secondaire

A

dérive directement d’un organe/tissu
cellules proliférantes n’ont plus de place à un moment, elles adhérent et rentrent en contact : pb = confluence de cellules
repiquage division par dilution
changement de support : resemencées -> culture secondaire
modèle cellulaire très proche des cellules in vitro mais limité temporellement car nb de divisions limité, arrêt du cycle cellulaire alors que cellule toujours vivante donc apoptose

91
Q

Modèle cellulaire : lignées de cellules

A

cellules immortalisées donc pas de pb de divisions

  • acquises spontanément (physio ou pathos =cancers) ex : cellules HeLa (Henriette Lack)
  • induites par des oncogènes
  • pas représentatives de vraies tumeurs : + de cellules + MEC + hypoxie intra tumorale
92
Q

Modèle cellulaire : sphéroïdes

A 
agrégat de cellules (100-400nm)
à partir de lignées tumorales
croissance en 3D et en suspension
support non adhérent
cellules en suspension dans un gel de protéines de MEC solubilisée
milieu de culture : agitation douce
cellule en contact = sphéroïdes
interaction cellule-cellule et cellule-MEC
gradient décroissant d'O2
93
Q

Culture en 2D, culture cellulaire

A

monocouche pr cellules adhérentes
en suspension dans liquide
support : flasque, plaque w/ puits, boite de pétri

94
Q

culture cellulaire : le milieu de culture

A 
riche en ions
facteurs de croissance (AA essentiels et vitamines)
glucose
serum veau foetal 
tampon CO2, hydrogénocarboné
95
Q

culture cellulaire : conditions de culture

A 
37°C
stérile sous hotte
\+/- 5% de CO2 (pas besoin si 1-2 j)
enceinte humide (85%)
surveillance MOCP
96
Q

Test de viabilité def

A

évaluer proportion de cellules mortes/vivantes dans culture

97
Q

Test de viabilité : technique pour marquer cellules vivantes

A

Fluorochromes avec Calcéine AM : substrat de l’estérase et seules les cellules vivantes ont de l’estérase fonctionnelles : marque en VERT

98
Q

Test de viabilité : technique pour marquer cellules mortes

A

Bleu de trépan : rentre dans toutes les cellules mais les vivantes l’éjectent donc marque les mortes

Fluorochromes avec iodure de propidium qui marque ADN quand membrane perméable, le cas quand cellules mortes ROUGE

99
Q

Qu’est-ce que la greffe cellulaire ?

A

restaurer les fonctions des organes/tissus altérés par accident/pathologie

100
Q

Greffe autologue/allogénique

A
  • autologue : même donneur et receveur

- allogénique : donneur et receveur différents

101
Q

Quels outils pour étude des cellules souches ?

A

CS adultes
CS embryonnaires humaines
C iPs

102
Q

Caractéristiques cellules souches

A

cellules indifférenciées : très immatures
non reconnues par aspect morphologique
capacité d’auto-renouvellement (maintien réserve)
capacité de différenciation (acquisition caract morphologiques pour assurer f° spécifique)
capacité de division asymétrique

103
Q

Quels sont les types de cellules souches ?

A

totipotente (orna entier, oeuf au stade pré-compaction)
pluripotente (Mcl morula, blastocyste + cellules issues des 3 feuillets et CS germinales)
multipotente (un seuil feuillet embryonnaire)
unipotente (lignée de cellules)

104
Q

Quelles sont les CS à intérêt thérapeutique ?

A

CsEH (FIV)
CS multipotentes (foetales et adultes)
CS adultes

Histologie (2 decks)

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