TEMA 2 - Enzimas implicadas en clonaje Flashcards
¿Qué características hacen a los plásmidos vectores de clonación ideales?
- Son moléculas de DNA circulares con su propio origen de replicación que se replican de manera autónoma en las bacterias, por lo que son capaces de generar una alta cantidad de copias dentro del huésped.
- Son moléculas de DNA extracromosómico (no se integran en el genoma) y que se hereda de manera estable (replicón) pero no modifican el genoma del huésped. Tienen origen de replicación y se replican de manera independiente a la bacteria huésped.
- La información genética que contiene no es esencial para el crecimiento de las células hospedadoras cuando están en medio no selectivo.
- Proporcionan funciones nuevas, como la resistencia a antibióticos, que permite seleccionar las células hospedadoras que lo contienen para la obtención de grandes cantidades por crecimiento selectivo. Pero no contienen información genética esencial para la bacteria.
¿Mediante qué maneras se puede introducir material genético en una bacteria?
- Conjugación: se produce de manera natural de una bacteria a otra.
- Transducción: el DNA proviene de un virus y al infectarse la célula se introduce.
- Transformación: consiste en generar condiciones químicas que permeabilicen de manera
transitoria la membrana de las células.
¿Qué son las bacterias competentes?
Bacterias competentes: Son bacterias modificadas químicamente (normalmente con CaCl2) para hacerlas transitoriamente permeables. Mediante cambio drástico de temperatura, conseguimos la permeabilidad que permite la introducción del plásmido.
¿Qué características tiene la cepa DH5alfa de E. coli?
DH5α: cepa de E. coli K12 que carece de la endonucleasa I (endA1) que permite un rendimiento alto de producción del plásmido, mutación en (recA1) que permite niveles bajos de recombinación homóloga, eliminación de endonucleasa EcoKI (hsdR17) que permite eficiente transformación de DNA no metilado.
¿Qué tipos generales de enzimas se utilizan en TAR?
- NUCLEASAS: enzimas que digieren (corta) el DNA específicamente.
- DNA LIGASAS: unen moléculas de DNA
- POLIMERASAS: sintetizan ácidos nucleicos (esta se utilizan principalmente en técnicas
que requieran PCR) - Modificación: enzimas que modifican los extremos del DNA.
¿Cuál es la reacción general de las nucleasas?
Eliminan nucleótidos mediante una reacción de hidrolisis que produce el corte de un puente fosfodiéster
¿Qué dos maneras hay de clasificar a las nucleasas?
A. Según la localización de corte:
- Exonucleasas: eliminan nucleótidos desde los extremos. Eliminan nucleótidos desde
el 5 ́al 3 ́o desde 3 ́al 5 ́ de cadena doble o cadena sencilla de DNA.
- Endonucleasas: producen cortes en el interior del ácido nucleico generando
pequeños fragmentos de DNA. Son enzimas de restricción que reconocen una
secuencia concreta
B. Según el tipo de molde:
- DNAasas: cortan DNA
- RNAasas: cortan RNA
¿Cuáles son las características de las exonucleasa del fago lambda y T7?
Exonucleasa del fago λ (E.coli) y de T7:
o Exonucleasas 5 ́-3 ́
o Tienen preferencia sobre dsDNA (ssDNA <100
veces)
o Generación de extremos 3’ protuberantes.
o Cortan extremos 5-P romos o retraídos
o No actúan en nicks (hueco en una de las cadenas
del DNA)
¿Cuáles son las características de las exonucleasa III de E. coli?
Exonucleasa III de E. Coli:
o Exonucleasa 3 ́-5 ́
o Corta dsDNA (No degrada ssDNA) o Genera extremos 5’ protuberantes o Corta extremos 3 ́-OH romos o
retraídos
o Sobre nicks produce gaps (genera un
hueco mayor)
Se utiliza para el marcaje terminal de fragmentos juntos con polimerasas, la preparación de ssDNA y en estudios de sitios de unión a proteínas.
¿Cuáles son las características de la nucleasa BAL-31?
Exonucleasas 3 ́y 5 ́de dsDNA y ssDNA/ssRNA Endonucleasa ssDNA:
Nucleasa BAL-31:
o Exonucleasa 3’y 5’
o dsDNA y ssDNA
o Actúa sobre dsDNA con extremos
romos
o Corta también a partir de nicks
o Se produce un acortamiento progresivo
de dsDNA
¿Qué son las enzimas de restricción?
Las enzimas de restricción son nucleasas que cortan DNA de doble cadena cuando reconocen un patrón de secuencia especifico. Los sistemas de restricción permiten a la bacteria monitorizar el origen del DNA que entra y destruirlo si lo reconoce como extraño.
¿Qué características tienen las enzimas de restricción tipo I?
- Estructuralmente complejo
- Actividades metilasa y nucleasa en una molécula proteica que contiene 3 subunidades:
Nucleasa R , Metilasa M y Reconocimiento de secuencia S. - Reconoce y metila secuencias especificas
- Ruptura al azar distanciada hasta 1000 pb
- Requieren ATP
Poco interés en técnicas de modificación del DNA.
¿Qué características tienen las enzimas de restricción tipo III?
- Son bastante raros
- Tienen ambas actividades metilasa y nucleasa en
una molécula proteica que contiene dos subunidades: Restricción R y Reconocimiento y metilación (SM) - Reconoce y metila la misma secuencia
- Ruptura a 24-26 bp
- Requieren ATP
Poco interés en técnicas de modificación del DNA.
¿Qué características tienen las enzimas de restricción tipo II?
- Los más comunes en bacterias
- Estructura sencilla
- Tienen ambas actividades metilasa y nucleasa en 2 enzimas independientes:
Reconocimiento y nucleasa (R) y Reconocimiento y metilasa (M) - Reconoce y metila la misma secuencia
- Ruptura en sitios específicos y definido (es mejor porque se puede diseñar un ensayo
preciso).
ALTO interés en técnicas de modificación del ADN
¿Qué ventajas presentan las enzimas de restricción tipo II?
Los sistemas de restricción Tipo II presentan varias ventajas para su uso en experimentos de clonaje y análisis del DNA:
- Cortan en posiciones definidas produciendo fragmentos de restricción discretos que dan lugar a patrones de bandas en geles de agarosa distintivos
- Es posible digerir el DNA en ausencia de modificación debido a que sus actividades de modificación y restricción se encuentran en enzimas separadas.
- La restricción no requiere cofactores como ATP o SAM, haciendo más fácil su uso
- La mayoría de estas enzimas generan extremos cohesivos que incrementan la ligación en
experimento de clonaje
¿En qué se basa la nomenclatura de las enzimas de restricción?
Se nombran con tres letradas del género y especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguidas a veces por una letra más, que identifica el serotipo (variante antigénica de la bacteria) y, finalmente, por un número romano que las identifica cuando en una misma variante se hayan encontrado varias enzimas con distinta especificidad.
¿Cómo son las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción tipo I?
Secuencia de reconocimiento palindrómicas: de 4-9 bp, continuas o discontinuas. (La secuencia de una de las cadenas se lee igual en la cadena complementaria en la misma polaridad, básicamente es igual pero al revés).
¿Qué quiere decir que las secuencias de reconocimiento de una enzima de restricción tipo II sea continua o discontinua?
¿Hay enzimas de restricción tipo II que reconozcan más de una secuencia?
Sí, algunas lo hacen.
¿Qué son los isoesquizómeros?
Isoesquizómeros: enzimas diferentes (de distintos organismos) que tienen especificidad por la misma secuencia de DNA y cortan en el mismo sitio.
- AhaIII; DraI: 5’-TTT/AAA-3’
- MboI; DpnII, NdeII, Sau3AI: 5’-/GATC-3 ́
- XmaIII; Eagl: 5 ́-C/GGCCG-3 ́
¿Qué son los neoesquizómeros?
Neoesquizómeros: reconocen la misma secuencia, pero cortan en diferente lugar del DNA.
- SmaI (CCC/GGG) y XmaI (C/CCGGG)
¿Qué son los isocaudómeros?
¿Qué extremos son compatibles entre fragmentos de restricción?
- Extremos romos generados por dos enzimas diferentes. → para hacer dos cortes compatibles
- Moléculas de DNA digeridas con la misma enzima (que no reconozca secuencias degeneradas).
- Extremos generados por isoequizómeros o por isocaudómeros.
¿Qué puede ocurrir al unir dos extremos compatibles?
¿Qué extremos no son compatibles?
- Los sitios de restricción ambiguos pueden generar extremos no compatibles.
- La digestión en secuencias discontinuas no genera siempre extremos compatibles debido
a la naturaleza aleatoria de los residuos centrales.
¿Qué diferencias hay entre los patrones de bandas de una complete digestion, actividad STAR y una digestión incompleta?
¿Qué son los mapas de restricción?
¿En qué consiste la ligación direccional?
¿Cómo se suele llevar a cabo un corte con una sola enzima de restricción?
¿En qué consiste la modificación de extremos protuberantes a extremos romos?
¿En qué consiste la modificación de extremos romos a extremos protuberantes (homopolymer tailing)?
¿Cómo se usan los adaptadores en la ligación de extremos no compatibles?
¿En qué consiste el relleno parcial de terminales protuberantes en 5’?
¿Cómo se usan los linkers en la ligación de extremos no compatibles?
¿Cuanta masa de inserto se utiliza durante la ligación?
¿En qué consiste el TA cloning?
¿EN qué consiste el TOPO cloning?
Utilizan una topoisomerasa en vez de la ligasa para hacer la unión pero es el mismo concepto que en el TA cloning.
¿Cómo se da el gateway cloning (recombinación homóloga en sitio específico) en el ciclo lisogénico del fago lambda?
¿Cómo se da el gateway cloning en el sistema recombinasa Cre en el sitio LoxP del Bacteriófago P1?
¿Cómo se da el gateway cloning con la flipasa en sitios FRT de S. cervesiae?
¿Qué es el seamless cloning?
¿En qué consiste el maracje por “Nick translation”?
Se utiliza DNasa 1 (proteínas que cortan el DNA) para generar nicks.
La DNA polimerasa I es capaz de extender estos nicks a través de la actividad exonucleasa 5 ́→3 ́
Los nucleótidos eliminados son reemplazados por dNTPs marcados con la actividad pol 5 ́→3 ́
¿Qué aplicaciones tiene el fragmento Klenow?
¿Qué es la retrotranscriptasa?
¿Cómo lleva a cabo su actividad la retrotranscriptasa?
- Actividad DNA polimerasa.
- Molde ssDNA o ssRNA.
- Actividad Rnasa H (elimina el mRNA para dar lugar a
ssDNA)
¿Cuáles son las aplicaciones de la retrotranscriptasa?
- Librerías de cDNA.
Está técnica se utilizaba antiguamente para identificar los mRNA que se había expresado. Consiste en introducir el cDNA en un plásmido para ver por marcaje que bacteria han expresado el gen. - RT-PCR: Amplificación de RNA mensajero para estudios de expresión. Por retrotranscripción se ve la expresión del mRNA.
