Techniques immunologiques et de biologie cellulaire

Question 1

Les Anticorps

Que reconnaissent spécifiquement les anticorps ?

Answer 1

Les antigènes, plus précisement l’épitope d’un antigène.

Question 2

Les anticorps

Par quoi sont synthétisés les anticorps ?

Answer 2

Par les lymphocytes B.

Question 3

Les anticorps

A quelle famille de protéines appartiennent les anticorps ?

Answer 3

A la famille des immunoglobulines.

Question 4

Les anticorps

Pourquoi dit on qu’un molécule d’anticorps est bivalente ?

Answer 4

Car elle possède deux sites d’intéractions avec l’antigène.

Question 5

Les anticorps

Donner la structure de base d’un anticorps- IgG
(dessiner)

Answer 5

• Deux chaînes lourdes identiques de 50kDa
• Deux chaînes légères identiques de 25kDa.
• Région variable
• Région constante
• Site de fixation de l’antigène.

Question 6

Les anticorps

Quels types d’interactions sont mises en jeu lors de la liaison anticorps-antigène ?

Answer 6

Ce sont des interactions non covalentes ( liaisons hydrogènes, interactions hydrophobe, liaison s de Van der Waals, liaisons ioniques).

Question 7

Les anticorps

Comment se nomme la partie de l’antigène reconnue par l’anticorps ?

Answer 7

L’épitope ( constitué d’une petite partie de l’antigène).

Question 8

Les anticorps

Dans le cas des antigènes protéiques de combien d’acides aminés est constitué un épitope ?

Answer 8

De 5 à 15 aa.

Question 9

Les anticorps

Quels sont les deux types d’épitope protéique ?

Answer 9

• Epitope séquentiel
• Epitope conformationnel.

Question 10

Les anticorps

Pourquoi un épitope peut être qualifié de séquentiel ?

Answer 10

Lorsqu’il correspond à une succession d’acides aminés au niveau de la séquence protéique. Il est présent dans la protéine native et aussi dans la protéine dénaturée.

Question 11

Les anticorps

Pourquoi un épitope peut être qualifié de conformationnel ?

Answer 11

En raison de l’organisation spatiale de la protéine: ses acides aminés sont les distants les uns des autres au niveau de la séquence primaire, mais proches dans l’espace en raison du repliement de la protéine.
Il est détruit lorsque la protéine est dénaturée.

Question 12

Les anticorps

Pourquoi l’affinité entre anticorps- antigène est très élevée ?

Answer 12

En raison de sa réversabilité, l’interaction suit la loi d’action de masse. L’association est extrêmement forte (constante de dissociation pouvant atteindre 10^-10 M.

Question 13

Les anticorps

Quels sont les deux catégories d’anticorps manipulés en laboratoire ?

Answer 13

Les anticorps polyclonaux et monoclonaux.

Question 14

Les anticorps

Est ce que les anticorps synthétisés par un même lymphocyte B sont identiques ? reconnaissent le même épitope ?

Answer 14

Oui, les anticorps synthétisés par un même lymphocyte B sont identiques et reconnaissent le même épitope.

Question 15

Les anticorps

Définir anticorps polyclonaux.

Answer 15

Naturellement présent dans le sérum d’un animal préalablement immunisé avec l’antigène d’intérêt.
Les anticorps polyclonaux sont constitués de différentes populations d’anticorps spécifiques du même antigène (ils proviennent donc de plusieurs lymphocytes B ) mais reconnaissent des épitopes différents de cet antigène.

Question 16

Les anticorps

Quels sont les avantages et les incovénients des manipulations avec des anticorps polyclonaux ?

Answer 16

Avantages: la fixation de plusieurs anticorps par molécule d’intérêt permet d’amplifier la réponse.
Inconvénients: variabilité d’un animal à l’autre, la source est limitée à la durée de vie de l’animal.

Question 17

Les anticorps

Définir anticorps monoclonaux.

Answer 17

Obtenus après immortalisation d’un lymphocyte B par formation d’un hybridome ( fusion lymphocyte B provenant de la rate d’une souris immunisé avec l’antigène d’intérêt, avec une cellule tumorale) qui in vitro sécrète l’anticorps de la spécificité désirée.
Un anticorps monoclonal c’est une population homogène d’anticorps synthétisée par un même clone d’hybridome B et spécifique du même antigène et du même épitope.

Question 18

Les anticorps

Donner les avantages et les inconvénients d’une manipulation avec les anticorps monoclonaux.

Answer 18

Avantages: possible de déterminer avec beaucoup de précision ses caractéristiques: isotype, affinité, épitope reconnu. Peut être congelé et stocké donc moyen de produire en quantité illimitée un anticorps.
Inconvénients: non

Question 19

Les anticorps

Comment sont définies les classes d’anticorps ?

Answer 19

Elles sont définies en fonction du type de chaînes lourdes qui les composent.

Question 20

Les anticorps

Elles sont définies en fonction du type de chaînes lourdes qui les composent. Les régions constantent des chaînes lourdes possédent une séquence d’acides aminés qui permettent de définir 5 classes d’immunoglobulines (ou isotype), lesquelles ?

Answer 20

IgM, IgD, IgG, IgE et IgA.
Les IgG représentent 75% des anticorps du sang.

Question 21

Les anticorps

Quelles sont les 4 sous classes d’IgG humaines ? (donner aussi celles des souris) ?

Answer 21

IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4.
Chez les souris: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3.

Les isotypes sont communs à tous les individus d’une même espèce. La séquence d’aa de la partie constante d’une chaîne lourde d’IgG1 de souris est identique chez toutes les souris mais différentes de celle d’une IgG1 de lapin.

Question 22

Les anticorps

Quelles sont les différentes techniques de recherche d’un antigène à l’aide d’un anticorps ?

Answer 22

• Immunocytochimie
• Immunofluorescence
• Cytométrie de flux
• Test ELISA
• Immunoprécipitation
• etc.

Question 23

Les anticorps

Que permet un test ELISA ?

Answer 23

Un test ELISA permet le dosage d’un antigène ou d’un anticorps spécifique dans un liquide biologique complexe. Il est basé sur l’absorption d’un Ac ou d’un Ag sur le plastique d’une plaque multi-puits et la détection des complexes Ag-Ac à l’aide d’un AcII couplé à une enzyme.

Question 24

Les anticorps

Que permettent les techniques d’immunocytochimie, immunohistochimie, immunofluorescence ?

Answer 24

Elles permettent de visualiser sur des coupes de tissus ou sur des cellules en culture la présence et la localisation d’une protéine in situ.
Lorsque l’AcII est couplé à une enzyme on parle d’immuno-chimie, lorsque l’Ac de détection est fluorescent on parlera d’immunofluorescence.

Question 25

# Les anticorps Qu'est ce la cytométrie en flux ?

Answer 25

C'est l'étude de cellules isolées entrainées par un flux liquide. C'est une technique de caractérisation individuelle, à la fois quantitative et qualitative, de particules en suspension dans un liquide.

Question 26

# Les anticorps En quoi consiste la cytométrie en flux ?

Answer 26

Elle consiste à analyser les signaux optiques ou physique émis par une particule lorsqu'elle coupe le faisceau lumineux d'un laser. Les signaux sont relatifs: - aux propriétés optiques intrintèques des particules - aux propriétés optiques induites de fluorescence.

Question 27

# Les anticorps Quelles sont les 3 informations sur la cellule que permet de recueillir la cytométrie en flux ?

Answer 27

- sa taille relative - sa granularité - son intensité relative de fluorescence dans plusieurs longueurs d'onde.

Question 28

# Les anticorps Donner les 4 étapes d'une cytométrie en flux. ## Footnote (voir schéma en supplément p30)

Answer 28

1- Passage des cellules dans la partie fluidique 2- Passage des cellules isolées devant le laser 3- Diffusion latérale de la lumière (SSC- granularité) Diffusion frontale de la lumière (FSC - taille) Mesure des signaux de fluorescence 4- Analyse quantitative des signaux lumineux et traitement informatique.

Question 29

# Les anticorps Donner les 5 étapes du principe de base de l'utilisation d'anticorps pour la détection d'un antigène.

Answer 29

Etape 1: l'antigène est déposé sur un support plastique (ELISA) ou une membrane de cellulose (W-Blot). (Interactions de type hydrophobes pour test ELISA). Etape 2: Saturation. La surface non occupée par l'antigène est saturée par des protéines (ex: albumine) qui se fixent non spécifiquement par des interactions à faible affinité à toutes les surfaces notamment l'antigène. Etape 3: Incubation avec l'anticorps primaire spécifique de l'antigène. L'affinité de l'anticorps pour l'antigène étant élevée, il déplace les protéines de saturation et intéragit avec l'épitope. Etape 4: Incubation avec l'anticorps secondaire spécifique de l'anticorps primaire et couplé soit à une enzyme, soit à une molécule radioactive ou fluorescente. ( AcII souvent Ac polyclonal pour amplifier le signal car plusieurs AcII se fixent sur un AcI). Etape 5: Révélation par ajout du substrat de l'enzyme. Le substrat est tranformé en produit détectable par spectrophotométrie.

Question 30

# Les anticorps Pourquoi l'étape de saturation est-elle nécessaire ( dans une majorité de cas) ?

Answer 30

Afin de limiter les phénomènes de fixation non spécifique des anticorps utilisés pour les étapes d'incubations.

Question 31

# Les anticorps Pourquoi est-il fondamental de réaliser des contrôles des expériences ?

Answer 31

Les contrôles sont nécessaires car ils permettent d'affirmer que la fixation de l'anticorps est bien spécifique et non aspécifique.

Question 32

# Culture cellulaire eucaryote animale Qu'est ce qu'une culture cellulaire ?

Answer 32

Il s'agit d'une opération permettant le maintien en dehors de l'organisme des cellules non organisées en tissu mais capables de se diviser in vitro.

Question 33

# Culture cellulaire eucaryote animale Quels sont les deux types de cellules animales que l'on peut retrouver en culture cellulaire ?

Answer 33

- Les cellules non adhérentes. Elles sont cultivées en suspension avec ou sans agitation. - Les cellules adhérentes, cultivées sur un support.

Question 34

# Culture cellulaire eucaryote animale Quelle est la différence entre les cultures primaires et les lignées cellulaires ?

Answer 34

Les cellules des cultures primaires sont prévelvées sur un organisme entier, elles finissent pas mourir. Les cellules de lignées cellulaires sont des cellules transformées expérimentalement ou qui proviennent de tumeurs.

Question 35

# Culture cellulaire eucaryote animale Quels sont les intérêts de la culture in vitro ?

Answer 35

-Etude d'un type cellulaire isolé plus simple. -Possibilité de déterminer les effets de l'addition ou de la suppression de molécules spécifiques sur le comportement cellulaire. -Production de protéines telles que les anticorps ou bien des protéines recombinantes. -Localiser et analyser la fonction des produits de gènes.

Question 36

# Culture cellulaire eucaryote animale Quelles sont les conditions de culture des cellules animales nécessaires ?

Answer 36

-Température aux alentours de 37°C - Humidité proche de 100 % - Equilibre gazeux: 5-10% de CO2.

Question 37

# Culture cellulaire eucaryote animale De quoi est composé un milieu de culture de base ?

Answer 37

D'acides aminés, de vitamines, de sels inorganiques et de sucres. On peut y ajouter du sérum comme source de facteurs de croissance, d'hormones et d'autres protéines.

Question 38

# La fluorescence et son utilisation en biologie cellulaire Qu'est ce que la fluorescence ?

Answer 38

Lorsque le rayonnement émis ne dure que pendant l'action de la lumière d'excitation.

Question 39

# La fluorescence et son utilisation en biologie cellulaire Quelles peuvent être les origines de la fluorescence en biologie ?

Answer 39

- Fluorescence naturelle: chlorophylle (émet une fluorescence rouge) - Substance fluorescente se fixant spécifiquement sur une structure : DAPI se fixe spécifiquement sur l'ADN ( fluorescence bleue). - Intégration d'une séquence codant une protéine naturellement fluorescente: GFP - Couplage de substance fluorescente sur des molécules biologiques (fluorochrome)

Question 40

# Adhérence cellulaire Quel type de protéines font intervenir les interactions entre cellules-cellules et cellules- MEC ?

Answer 40

Ce sont de protéines transmembranaires appelées protéines d'adhérence.

Question 41

# Adhérence cellulaire Quels sont les deux types d'adhérences via les intégrines ?

Answer 41

-Les contacts focaux (liaison MEC-actine) - Les hémidesmosomes ( liaison laminine-filaments intermédiaires).

Question 42

Qu'est ce que la trypsine ?

Answer 42

Il s'agit d'une enzyme protéolytique permettant de cliver les protéines d'ancrage des cellules au support.

Question 43

Qu'est ce que l'EDTA ?

Answer 43

C'est un agent chélateur des cations bivalents qui permet d'inhiber les interactions cellulaires dépendantes du calcium et du magnésium. Dans un milieu il permet de maintenir les cellules en suspension, il inhibbe l'agrégation cellulaire.

Question 44

Qu'est ce que la fibronectine ?

Answer 44

C'est une glycoprotéine extracellulaire qui joue un rôle dans l'adhésion cellulaire, la migration, la prolifération et la différenciation des cellules.

Question 45

Que permet le tampon PBS ?

Answer 45

Maintient d'un pH constant, environnement ionique stable.

Question 46

# Adhérence cellulaire Comment se font et que permettent les interactions cellules-MEC ?

Answer 46

Les interactions cellules-MEC se font par des protéines réceptrices transmembranaires ( intégrines) ou encore des ligands de la MEC ( fibronectine, collagène, laminine,..). Elles assurent la liason entre la MEC et les microfilaments d'actine du cytosquelette.

Question 47

# Adhérence cellulaire Donner une définition de la matrice extra cellulaire.