Technique de séparation de molécules Flashcards
Que nécessite la majorité des projets en recherche pour les analyser
-extraction
-enrichissement
-purification
Que sont les paramètre de purification
-taille
-solubilité
-charge
-densité
-marqueur ajouté ou ‘tag’
Quel est la première étape de la purification pour libérer leur contenu
tampon de lyse (extraction)
selon quel critères il faut adapter les techniques d’extraction
-type de matériel
-cellules animal, levure bactéries?
-volume à extraire
-nature de ce qu’on veut purifier
-souvent combinaison de traitement mécanismes chimiques et enzymatiques
que veut-on faire dans la méthode d’extraction dans le cas des cellules
retirer le milieu de croissance et resuspendre dans le tampon de lyse
que doit-on faire pour les cellules en suspension
les passer à la centrifugeuse à basse vitesse
Que doit-on faire pour les cellules adhérentes
une trypsinisation suivie d’une centrifugation. parfois utilisation d’une enzyme protéase pour décoler les cellules du plastique
Quelles sont les méthodes d’extraction mécaniques
-mortier et pillon
-mélangeur (waring blender)
-homogénéisateur de type rotor-stator
-homogénéisateur de type Dounce et Potter-Elvehjem
-homogénéisateur à billes (bead beater)
-homogénéisateur à haute pression
-sonification
avantages/inconvénient de mortier-pillon
avantage:
-très efficaces pour les tissus rigides
-préserve les biomolécules
-peu couteux
désavantage:
-méthode lente et manuelle
-nécessite de l’azote liquide
-peu adapté au grands volumes
avantages/inconvénient du blender mécanique
avantage:
-convenient pour grand volume
-rapide pour homogénéiser des tissus durs précoupés
-peu couteux
désavantage:
-génère beaucoup de chaleur
-moins précis pour libérer le contenus cellulaires
-non adaptés au petits volumes
avantages/inconvénient de l’homogénéisateur de type motor-stator
avantage:
-rapide et efficace pour homogénéiser des tissus mous
-adapté aux grands volumes
-possibilité de préserver les organites cellulaires
désavantages:
-moins efficace pour les tissus rigides
-génère de la chaleur nécessitant un refroidissement
avantages/inconvénient de l’homogénéisateurs de type Dounce et Potter-Elvehjem
avantage:
-préserve les organites cellulaires (noyaux, mitochondrie)
-méthode douce pour lyse partielle
Désavantages
-moins efficace pour les cellules robustes (bactéries, levures)
-inefficace pour les tissus rigides
avantages/inconvénient homogénéisateur à billes
avantages:
-très efficaces pour les parois épaisses
-homogène pour petits volumes
désavantages:
-génère de la chaleur
-inefficace pour des grands morceaux de tissu
avantages/inconvénient homogénéisateur haute pression
avantages:
-très efficace pour lyser les bactéries et levures robustes
désavantages:
-inefficace pour tissus rigides (cartilage,os)
-limité aux suspensions liquides
-volumes traités souvent restreints
avantages/inconvénient ultrasonique (sonification)
avantage:
-efficace pour les bactéries et les cellules individuelles
-facile à utiliser pour suspensions
désavantages:
-génère de la chaleur (glace)
-peut fragmenter l’ADN ou dénaturer les protéines sensibles
Quelles sont les méthodes d’extraction enzymatiques
-traitement enzymatique pour briser la MEC des tissus
-traitements enzymatiques pour fragiliser les parois
Qu’est-ce que le traitements enzymatiques pour briser la MEC des tissus
-pratique pour isoler cellule intact
-nécessite un pré-traitement dans un tampon adapté
Qu’est-ce que les traitements enzymatiques pour fragiliser les parois
-possible d’utiliser des enzymes pour dégrader la paroi
-prétraitement dans un tampon adapté
-souvent en combinaison avec lyse douce (détergents mom-ioniques, sonification…)
Quelles sont les méthodes d’extraction chimiques
-détergents non ionique
-agents osmotiques
-enzyme pour dégrader la paroi
-détergents ioniques
-agents chaotropiques
2 exemples de détergents
-SDS : détergent ionique fort dénaturant
fort pouvoir moussant
-Triton X-100 : Détergent non-ionique, moins irritant que le SDS
Que font les agents chaotropiques
Ils brisent presque tout. Ils dénaturent les protéines et sont corrosif. Ils sont très pratique pour extraire des protéines insolubles, dénaturation des acides nucléiques (protéine membranaire)
à quoi sert le mélange phénol-chloroforme
-extraire les acides nucléiques.
-Le phénol dénature les protéines et le chloroforme dissout les membranes
-Souvent en combinaison avec détergents ou agents chaotropique pour aider à la lyse
Est-ce que les détergents non ionique sont dénaturant
non
Est-ce que les agents osmotiques sont dénaturant
non (parfois)
Est-ce que les enzymes pour dégrader la paroi sont dénaturant
non
Est-ce que les détergents ionique sont dénaturant
oui
Est-ce que les agents chaotropique sont dénaturant
oui
Description des détergents non ioniques
perturbent doucement les membranes lipidiques sans dénaturer les protéines
agents osmotiques description
Provoquent une entrée ou une sortie d’eau dans les cellules, entrainant leur éclatement ou fragilisation
enzymes pour dégrader la paroi description
dégradent spécifiquement la paroi cellulaire
détergents ioniques description
détruit les membranes lipidiques et dénature les protéines
agents chaotropiques description
déstabilisent les interactions hydrophobe et hydrogènes , dénaturent protéines et acides nucléiques, dissocient les membranes
S’il faut préserver la conformation/activité/structure des molécules :
-lyse en milieu physiologique avec système tampon
-lyse douce + précaution à prendre
-travailler sur glace
-réactif qui ne contienne pas d’ARNase
-Utilisateur d’inhibiteur de protéases
-Ajout d’agents réducteurs
Exemple d’inhibiteur de protéases
-PMSF
-EDTA
-EGTA
-etc…
La diversité de techniques de purification
-dialyse
-filtration
-centrifugation
-précipitation
-chromatographie
-etc…
dialyse défénition
-2 compartiments séparés par une membrane semi-perméable
-Diffusion de solutés grâce à un gradient de concentration (atteinte de l’équilibre)
Que sont les utilisations de la dialyse
-dessalage
-retrait des contaminants
-concentrations des protéines
-modifications du pH
Que passe à travers les membranes
les petites molécules (ions)
les grosses molécules ne passent pas
Qu’est-ce que la filtration
Utilisation de filtres avec une porosité de grande taille avec basse pression, principalement utilisé pour retirer des débris cellulaires, des bactéries et des résidus solides
Quand la filtration est-elle effectuée
après l’extraction et avant la purification
Qu’est-ce que l’ultrafiltration
l’utilisation de filtres avec une porosité de petite taille avec une haute pression, principalement utiliser pour concentrer les macromolécules et éliminer les petites molécules.
Plus adaptée aux petits volumes
