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Genetic Engineering Lab > Segundo Registro > Flashcards

Segundo Registro Flashcards

1
Q

Aplicaciones de la PCR?

A

Amplificación de secuencias a partir de DNA molde. Detección de genes y mutaciones. Síntesis de cDNA a partir de RNA

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Q

Pasos principales de PCR

A

Desnaturalización, alineación y amplificación

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3
Q

¿Cómo es el proceso de amplificación?

A

Exponencial

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4
Q

¿Qué material se necesita para hacer PCR?

A 
DNA templado
Taq Polimerasa
MgCl2
Primers
dNTP's
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Q

¿Qué es la Taq Polimerasa?

A

Enzima termoestable, aislada de Thermus aquaticus o Pyrococcus furiosus.

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6
Q

¿Cómo es la actividad de Taq Polimerasa?

A

Puede tener actividad de DNA polimerasa de 5’ a 3’ o exonucleasa con generación de extremos con A o en Pfu

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7
Q

¿Cómo varían las polimerasas?

A

Varían en fidelidad y procesividad

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8
Q

¿Cuántos tipos de PCR hay?

A

Anidado, RT-PCR, multiplex, hot start, colony, PCA, Real Time, Droplet Digital

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9
Q

¿Qué puntos hay que considerar para el diseño de primers?

A

Porcentaje de GC, longitud, Tm y temperatura de alineamiento, formación de hairpins, dimerización, sitios de restricción y primers degenerados

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10
Q

Porcentaje de GC, ¿qué hay que considerar?

A

Debe estar en 40-60%, 50% es el óptimo, no se recomiendan regiones largas de A/T porque se debilita hibridación, regiones largas de G/C pueden promover mal alineamiento, se deben evitar secuencias de repetidos

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11
Q

Longitud de primers, ¿qué hay que considerar?

A

Primers muy cortos son de baja especificidad y muy largos decrementan eficiencia. La longitud ideal es de 18-30 pb o 30-35 pb para PCR multiplex.

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12
Q

¿Qué es Tm?

A

Es la temperatura a la cual el 50% del DNA de doble cadena se disocia en ssDNA

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13
Q

Tm, ¿qué hay que considerar?

A

Se basa en la temperatura de fusión de los cebadores, se determina por la longitud, composición y concentración del primer, se ve afectada por concentración de sal. La ideal se encuentra en 52ºC -60ºC. Ambos primers deberían de estar alejados máximo por 5ºC

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14
Q

¿Cuál es la fórmula para calcular Tm?

A

Tm= 2(A+T) + 4(G+C)

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15
Q

¿Qué es un homodímero?

A

Se forma entre dos primers Fw o dos Rv. Es aceptable cuando la ΔG >-5 kcal si se forma en extremo 3’ o ΔG>-6 si es un homodímero interno

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16
Q

¿Qué es un heterodímero?

A

Se forma entre un primer Rv y uno Fw. Es aceptable cuando la ΔG >-5 kcal si se forma en extremo 3’ o ΔG >-6 si es un heterodímero interno.

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17
Q

¿Qué es un hairpin?

A

Se forma por interacciones intramoleculares, afecta la amplificación. Es aceptable si la ΔG >-2 kcal si se forma en extremo 3’ o ΔG>-3 si es un hairpin interno

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18
Q

Primers degenerados, ¿qué hay que considerar?

A

Se usan cuando se quiere amplificar un gen y solo se conoce parte de la secuencia.

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19
Q

Desventajas de usar primers degenerados

A

Se incrementa el riesgo de amplificación inespecífica. Se disminuye la concentración en la mezcla

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20
Q

Aplicaciones de la purificación de producto de PCR

A

Sirve cuando se tienen productos inespecíficos de PCR, cuando hay exceso de templado o de dNTP’s, sirve para clonación o purificar fragmentos de restricción

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21
Q

¿Cuál es la metodología de purificación?

A

Correr el gel, visualizar el gel y cortar la banda de interés. Se puede purificar por extracción con fenol, electroelución o columna

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22
Q

¿En qué consiste la extracción fenólica?

A

Fundir el fragmento de agarosa, adicionar 1 volumen de FCA, centrifugar y recuperar fase acuosa, recuperar el DNA por precipitación con etanol y acetato de sodio

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23
Q

¿En qué consiste la electroelución?

A

Aplicar un voltaje para favorecer la migración de DNA y luego atraparlo en una trampa de sal luego precipitar con etanol absoluto

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24
Q

¿En qué consiste la purificación con columna?

A

Cortar banda, añadir volumen de buffer de solubilización, añadir volumen de isopropanol, cargar columna, añadir wash buffer, añadir buffer de elución y eluír DNA

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25
Q

¿Cómo se verifica purificación?

A

Midiendo el indice A260/A280 en el espectrofotometro y calculando la concentración

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26
Q

Beneficios de E. Coli

A

Rápido crecimiento, alto nivel de expresión, facilidad de obtención de biomasa, bajo costo, genoma conocido, fácil manipulación genética

27
Q

Mecanismos para adquirir información genética

A

Conjugación, transducción, transofrmación

28
Q

Factores que afectan eficiencia de transformación

A

Debe estar en fase log, temperatura debe ser 4ºC, cantidad de DNA debe estar purificado, plásmido debe estar superenrollado para mejor eficiencia.

29
Q

¿En qué consiste la transformación?

A

Bacteria capta DNA externo y puede incorporarlo a DNA cromosómico

30
Q

¿En qué consiste la transformación química?

A

Membrana está compuesta de moléculas de lípidos cargados negativamente, hay zonas de adhesión que permiten paso de DNA, los iones de calcio neutralizan la carga negativa

31
Q

¿Qué otras sales se ocupan para transformar quimícamente?

A

Rubidio, Manganeso, Potasio, Sodio

32
Q

¿Cuál es el papel de la temperatura en la transformación química?

A

El choque térmico modifica la permeabilidad de la membrana. La temperatura óptima es de 42ºC

33
Q

¿En qué consiste la electroporación?

A

Se utiliza un campo eléctrico para permeabilizar las células y permitir el paso de DNA aunque muchas células mueren

34
Q

Factores de la electroporación

A

Entre más grande sea el plásmido menor será la eficiencia. Se debe mantener la celda y bacterias a 4ºC

35
Q

¿Cómo se mide la eficiencia de transformación?

A

Eficiencia = (UFC/ng DNA)(1x10^3 ng/microgramos) * FD

36
Q

¿En qué consiste la Colony to Lawn Transformation?

A

Se utiliza cuando se tiene un plásmido en una bacteria y se quiere transferir a otra bacteria.

37
Q

Metodología de Colony to Lawn

A

Tomar colonia de cepa donadora, disolver en agua y etanol, agregar CaCl2, tomar muestra de bacterias receptoras, mezclar y transformar

38
Q

¿En qué consiste la Plate Transformation?

A

Se evita el procesamiento y lavado de bacterias

39
Q

Metodología de Plate Transformation

A

Se prepara un cultivo fresco con DO en fase log, se mezcla con plásmido y se espatula en placa con agente de selcción que ademas tiene CaCl2

40
Q

¿En qué consiste la One Step transformation?

A

Se evitan centrifugados, lavados y choque térmico

41
Q

Metodología de One Step Transformation

A

Inocular MC nuevo con uno semilla, incubar hasta DO de 0.4, adicionar buffer TSS, mezclar mezcla anterior con 100 ng de plásmido, incubar, agregar medio LB, espatular en placas con agente de selección

42
Q

¿En qué consiste la sonoporación?

A

Basado en generacion de vibracion que provocan efecto cavitacional, se utiliza en bacterias termofilicas gram positivas anaerobias

43
Q

Metodología de Sonoporación

A

Mezclar plasmido con CaCl2, someter a frecuencia de 40 kHz en sonicador a 22ªc pro 10 sgs, espatular en medio de selección

44
Q

¿En qué consiste Tribos Transformation?

A

Usa fibras de asbesto para penetrar membrana mediante fricción y deslizamiento en agar

45
Q

Metodología de Tribos Transformation

A

Esparcir mezcla de bacterias y fibras de crisotilo sobre agar con varilla de plástico, generar fuerza de fricción mientras la placa gira (aparato especial)

46
Q

¿Cómo actúa topoisomoerasa I?

A

Se une a 5’ CCCTT y corta en el esqueleto fosfodiester dejando libre una T, se mantiene unidad de manera covalente gracias a Tyr 274 y el fosfato del sitio de corte, este enlace se desestabliliza en presencia de producto con A en cada extremo y se aparea con T libre.

47
Q

¿Qué es un plásmido?

A

DNA de replicación autonoma y que es utilizado como receptor de DNA foráneo

48
Q

Propósitos de un vector

A

Producción de ssDNA, sobreexpresión de proteínas, producción de RNA, mutagénesis.

49
Q

¿Qué es un plásmido episomal?

A

No se inserta al genoma, es independiente y esto facilita su manipulación y aislamiento.

50
Q

Elementos comunes de los plásmidos

A

Marcador de selección (gen reportero o de resistencia), sitios polylinker, MCS, tags, proteínas de fusión. promotores.

51
Q

Características principales de plásmidos

A

Tamaño moderado, forma circular, ori independiente del control directo de la replicacion, variación de numero de copias, presencia de marcadores de selección, MCS

52
Q

¿Qué es un plásmido lineal?

A

Se reproduce de manera autónoma y se les llama replicones

53
Q

¿En qué se basa la lísis alcalina?

A

Alcalisis fuerte para lisar y luego neutralizar para recuperar DNa plasmídico

54
Q

¿Cómo funciona Miniprep con buffer STET?

A

Utiliza detergentes especiales y lisozima para abrir poros en membrana para obtener plásmido

55
Q

¿Función de girasa?

A

Torción en plásmidos que enrollan el DNA y optimiza el espacio disponible

56
Q

¿Qué isoformas se pueden observar?

A

Superenrollado, lineal completo y circular relajado

57
Q

¿En qué consiste la PCR anidada?

A

Amplificar región más grande que la de interés

58
Q

¿En qué consiste la RT-PCR?

A

Síntesis de RNA a cDNA

59
Q

¿En qué consiste la PCR Multilex?

A

Varios sets de primers, con Tm’s similares que permitan utilizar todos al mismo tiempo

60
Q

¿En qué consiste la PCR Hot Start?

A

Polimerasa con anticuerpo acoplado para eliminar inespecificidades y evitar que amplificación inicie antes de entrar a termociclador

61
Q

¿En qué consiste la PCR Colony?

A

Se evita extracción de plásmido , bacteria con plásmido se diluye y se ocupa como templado

62
Q

¿En qué consiste la PCA?

A

Ensamblar genes o secuencias de novo on varios oligos que hibiridan entre ellos y rellenan los espacios vacíos

63
Q

¿En qué consiste la PCR Real Time?

A

Se puede ver si se amplifica al mommento con sondas TaqMan o SYBR Green

64
Q

¿En qué consiste la Droplet Digital?

A

Tipo emulsión con gotas de aceute mineral, en cada gota se hace la amplificación y se puede monitorear Real Time

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