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GENÉTICA SEMESTRAL > SECUENCIACIÓN > Flashcards

SECUENCIACIÓN Flashcards

1
Q

Función de la secuenciación de ADN

A

Determinar la secuencia de nucleótidos de una muestra de ADN

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Q

Primeras técnicas de secuenciación

A

Método de Maxam-Gilbert
Método de terminación de cadena de Sanger

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Q

Método de secuenciación más sencillo y preciso utilizado en el proyecto del genoma humano

A

Método de terminación de cadena de Sanger

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4
Q

En qué se basa el método de terminación de cadena de Sanger

A

En el uso de dideoxinucleótidos trifosfatos (ddNTPs), que entran en contacto con el DNA-polimerasa y esta no puede enlazar otros nucleótidos de ddNTPs

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5
Q

En qué consiste la secuenciación de Sanger

A

Hacer muchas copias de una región blanco de ADN

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6
Q

Reactivos utilizados en la secuenciación de Sanger

A

-Enzima ADN polimerasa
-Cebador
-Deoxinucleótido trifosfato (dNTP)
-Molde o plantilla de ADN que será secuenciado

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7
Q

Es un fragmento pequeño de ADN monocatenario que se une al molde de ADN y actúa como un “iniciador” de la polimerasa.

A

Cebador

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8
Q

Tipos deoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) utilizados en la secuenciación de Sanger

A

dATP, dTTP, dCTP, dGTP

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9
Q

En la secuenciación de Sanger se utilizan reactivos necesarios para la replicación del ADN en un organismo o para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que copia el ADN in vitro. Cierto o Falso

A

Cierto

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10
Q

Ingrediente único de la Secuenciación de Sanger

A

Dideoxinucleótidos o terminadores de cadena

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11
Q

En la secuenciación de Sanger, cada uno de los cuatros nucleótidos está marcado con un color diferente. Cierto o Falso

A

Cierto

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12
Q

Tipos dideoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) utilizados en la secuenciación de Sanger

A

ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP

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13
Q

Nucleótido que le fatan dos grupos -OH

A

Dideoxinucleótidos trifosfatos

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14
Q

Características de los ddNTPs

A
  1. Marcados con flurorescencia o radioactividad
  2. Finalizan la copia tras añadirse
  3. Tras varias interacciones podemos tener copias de la longitud que queramos
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15
Q

Colores de los ddNTPs

A

ddTTP-rojo
ddCTP-azul
ddATP-verde
ddGTP-morado

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16
Q

Usos de la Secuenciación de Sanger

A
  1. Arroja secuencias de alta calidad para segmentos relativamente largos de ADN 900 pb.
  2. Secuenciar fragmentos individuales de ADN como plásmidos bacterianos o ADN copiado en la PCR
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17
Q

Limitaciones de la Secuenciación de Sanger

A
  1. Costosa e ineficiente para proyectos a gran escala como un genoma completo o metagenoma
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18
Q

Genoma colectivo de una comunidad microbiana

A

Metagenoma

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19
Q

Alternativa más moderna a la secuenciación de Sanger, más rápida y más barata pero MENOS PRECISA

A

Pirosecuenciación

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20
Q

En qué se basa la pirosecuenciación

A

Aprovecha el trifosfato que se libera cuando el dNTP se une la cadena, en forma de pirofosfato (PPi)

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21
Q

Enzimas adicionales en la Pirosecuenciación

A

ATP-sulfurilasa
Luciferasa
Aspirasa

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22
Q

Sustratos adicionales en la Pirosecuenciación

A

Adenosin-fosfosulfato (APS)
Luciferina

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23
Q

Las enzimas en la pirosecuenciación van a tener reacciones naturales que generan señales luminosas ahorrando marcas fluorescentes haciendo el proceso más rápido y barato. Cierto o Falso

A

Cierto

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24
Q

Ventajas de la pirosecuenciación

A

-Muy rápido hasta 700Mbps
-Más barato que Sanger
-Precisión bastante alta

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25
Q

Desventajas de la pirosecuenciación

A

-No puede generar secuencias muy largas
<1Kbs
-Problemas para medir homopolímeros

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26
Q

Secuencias de varios nucleótidos iguales

A

Homopolímeros

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27
Q

Pasos de la pirosecuenciación

A
  1. Partimos de una secuencia plantilla y un primer, con + enzimas y sustratos y isn etiquetas los dNTPs
  2. La polimerasa une un dNTP liberando un PPi en el proceso
  3. La ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP con ayuda del APS
  4. La luciferasa convierte el ATP en luz con ayuda de la luciferina
  5. Medimos un pulso de luz
  6. La aspirasa se libra de los reactivos sobrantes para que el sistema esté limpio para el siguiente dNTP
  7. El resultado son picos de intensidad
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28
Q

Convierte el PPi en ATP con ayuda del APS

A

ATP sulfurilasa

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29
Q

Convierte el ATP en luz con ayuda de la luciferina

A

Luciferasa

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30
Q

Secuenciador para Sanger y análisis de fragmentos de ADN

A

ABI 3130/3130XL

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31
Q

Secuenciador para Pirosecuenciación

A

PYROMARK Q24

32
Q

Grupo de tecnologías diseñadas para secuenciar gran cantidad de segmentos de ADN de forma masiva y en paralelo, en menor cantidad de tiempo y a un menor costo por base

A

NGS

33
Q

Uso inicial de NGS

A

Detectar variantes de nucleótidos único, ahora también se usa para inserciones, deleciones y grandes rearreglos

34
Q

Aplicaciones de NGS

A

Prevención, diagnóstico, tratamiento y el seguimiento de un amplio espectro
de enfermedades, incluidas condiciones genéticas, patologías crónicas y
enfermedades infecciosas

35
Q

Prueba estándar para
la detección de variantes en el ADN.

A

NGS

36
Q

Su precisión y relativamente sencillo análisis de datos han permitido su uso en el diagnóstico de enfermedades monogénicas

A

NGS

37
Q

Desventaja de NGS

A

-Proceso largo y tedioso en enfermedades que exhiben heterogeneidad genética
-Precio muy elevado

38
Q

Se analizan feagmentos superpuestos de ADN por separado y luego se ensamblan en una solo secuencia continua

A

Secuenciación en escopeta

39
Q

El ADN se fragmenta aleatoriamente

A

Shotgun sequencing

40
Q

Cómo se clonan y se almacenan los fragmentos en la Shotgun sequencing

A

Se clonan en forma d ecromosomas artificiales de bacterias BAC
Se almacenan en bibliotecas según tamaño, jerarquía

41
Q

Cómo se almacenan los BAC

A

-Fragmentos grandes 100-500 kb
-Cósmidos 50kb
-Plásmidos 2kb

42
Q

Los clones BAC se secuencian, obteniendo secuencias desordenadas. Y se ordenarán con el ensamblado
Cierto o Falso

A

Cierto

43
Q

Porción genética codificante completa

A

Exoma

44
Q

Se refiere al porcentaje de bases del genoma de referencia que están siendo secuenciadas una cantidad determinada de veces

A

Cobertura

45
Q

Representa el número promedio de veces que cada base en el genoma es
secuenciada en los fragmentos de ADN

A

Profundidad

46
Q

Los valores apropiados de profundidad dependerán de

A
  1. Aplicación de la técnica de secuenciación
  2. Frecuencia alélica de las variantes que se analizarán
47
Q

Illumina se caracteriza por

A
  1. Amplifiación de los fragmentos de ADN para la generación del clúster mediante PCR en puente
  2. Detección de bases en la secuenciación a través de etiquetas fluorescentes.
48
Q

Proceso que se logra mediante el método de amplificación en puente

A

Generación de clúster

49
Q

Proceso de generación de clúster

A
  1. Fragmentos de ADN se colocan sobre un superficie sólida de vidrio separada por carriles
  2. El fragmento de ADN se ancla a la celda de flujo por medio de la unión de sus adaptadores a los oligonucleótidos complementarios.
  3. La polimerasa genera una hebra reversa complementaria y la hebra original es retirada.
  4. La hebra reversa se pliega y queda en forma de puente, donde la polimerasa genera una hebra complementaria idéntica a la original.
  5. Al final se retirar todas las hebras reversas y quedan las idénticas a las originales.
  6. En la placa se introducen nucleótidos modificados con etiquetas fluorescentes específicas para cada tipo.
50
Q

Evita la unión de más de un nucleótido marcado en cada sitio de reacción dismiuyendo el riesgo de errores

A

Terminadores reversibles

51
Q

Se lleva acabo en un chip semiconductor y se utiliza PCR de emulsión

A

Secuenciador Ion Torrent

52
Q

Secuenciación mediante ion semiconductor

A
  1. Un nucleótido es ligado a la hebra que se va a secuenciar, se forma un enlace covalente y se libera un H+
  2. Se da un cambio de pH y se genera una corriente eléctrica
  3. ISFET detecta voltaje
53
Q

Secuenciación mediante ion semiconductor se basa en

A

Detección del cambio de voltaje por medio de un sensor llamado ISFET que indica que el nucleótido se ha incorporado correctamente.

54
Q

En esta técnica, los nucleótidos no están modificados con terminadores reversibles

A

Secuenciación mediante ion semiconductor

55
Q

En la secuenciación mediante ion semiconductor que sucede si hay homopolímeros

A

El pH disminuirá en mayor proporción y la diferencia de voltaje aumentará proporcionalmente al número de bases añadidas

56
Q

Ocurre de forma paralela en todos los pocillos del chip y alcanza una longitud de lectura de hasta 400 pares de bases

A

Secuenciación de ion semiconductor

57
Q

Es una prueba que secuencia un número determinado y específico de genes que están relacionados con una enfermedad o grupo de
enfermedades. DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

A

Secuenciación de panel de genes

58
Q

Cuándo se recomienda el uso de la secuenciación de panel de genes

A

Cuando en el paciente se observe un fenotipo característico y se sospeche de una enfermedad gnética causada por una lista de genes

59
Q

Ventaja de la secuenciación de panel de genes

A

Menor costo, más rápida, mayor profundidad, interpretación y análisis sencillos

60
Q

Desventaja de la secuenciación de panel de genes

A

La información de población latinoamericana está subrepresentada, se dificulta interpretación clínica

61
Q

En Panamá se utiliza las siguientes secuenciación de paneles

A
  • Panel para Exoma Clinico (4200 genes)
  • Panel para Cardiopatías Hereditarias (128 genes)
  • Panel para Cáncer Hereditario
  • Panel para Neoplasias Mieoloides
62
Q

En esta prueba se secuencian todas las regiones codificantes del genoma

A

Secuenciación completa de exoma

63
Q

Representa entre el 1 y el 2 % de la
secuencia genómica completa y donde se hallan hasta el 85 % de las variantes genéticas reportadas como patogénicas

A

Exoma

64
Q

De gran utilidad en pacientes que padecen enfermedades con gran heterogeneidad genética, como el autismo, o que presenten un fenotipo complejo, donde el cuadro clínico no es lo suficientemente característico de una variante o de uno o varios genes específicos.

A

Secuenciación completa de exoma

65
Q

Desventajas de la secuenciación completa de exoma

A

No está diseñada para identificar variantes patogénicas que se encuentren en regiones no codificantes como intrones o regiones promotoras

66
Q

Primera prueba diagnóstica en transtornos del neurodesarrollo

A

Secuenciación completa de exoma

67
Q

Evalúa todas las bases del genoma, incluyendo las regiones no codificantes.

A

Secuenciación completa de genoma

68
Q

Mejor prueba para la detección de nuevas variantes genéticas y estructurales que no se asociaban con el cuadro clínico que se iba a estudiar

A

Secuenciación completa de genoma

69
Q

De gran utilidad en enfermedades genéticas raras en las que no es posible llegar al diagnóstico y cuando el fenotipo del paciente pueda ser explicado por una variante de novo.

A

Secuenciación completa de genoma

70
Q

La prueba con menos sesgos durante el análisis de genes, debido a que la secuenciación no está dirigida hacia genes específicos.

A

Secuenciación completa de genoma

71
Q

Variantes que tienen evidencia fuerte de asociación con enfermedad.

A

Patogénica

72
Q

Variantes que probablemente están implicadas con enfermedad, pero no hay evidencia suficiente para demostrar asociación

A

Probablemente patogénica

73
Q

Variantes con posibles cambios funcionales, pero con evidencia contradictoria o insuficiente como para considerarla beningna o patogénica

A

Significado incierto VUS

74
Q

Variantes con evidencia que sugiere benignidad pero con datos débiles en la literatura que no descartan impacto biológico y eventualmente clínico

A

Probablemente benigna

75
Q

Varientes genéticas que no alteran funcionalidad

A

Benigna

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