Secuenciación Flashcards
tipos de secuenciacion
- método de SANGER
- Maxam-Gilbert
- Secuenciación de segunda generación
característics principales del método de SANGER
- se basa en la adición de ddNTPs
- 1977
fundamento del metodo SANGER
- es basado en la replicacion de la molecula de ADN con ayuda de un ADN polimerasa
- terminadores
metodología del metodo de SANGER
- aislar
- clonar
- desnaturalizar
- iniciador marado
- marcaje de ddNTPs
- mezcla se divide en 4 partes
- ddATPs en exceso
cantidad de nucleotidos en los fragmentos que se pueden leer utilizando el metodo de sanger?
fragmentos de 50 a 300 nucleotidos
pre-tRNA cantidad de nucleotidos
75-80
pasos de la maduracion de pre-tRNA
- eliminacion del intron por medio de splicing
- secuencia 5’ elimina ribonucleasa P
- Resiudo UU (3’) es remplazado por ACC
- distintas bases son modificadas en el proceso de maduración
cantidad de nucleotidos en un intron
14
es requerido durante la sintesis de proreinas
ACC
secuenciación automatizada
- PCR con fluoresencia, cadena terminadora de nnNTPs
- separación por capilaridad en un gel de electroforesis
- excitacion por laser y detección por maquinaria de secuencia
PCR con fluoresencia
- amplifica y desnaturaliza la secuencia original del ADN por medio de PCR
- mezcla de dNTPs y fluoresencia ddNTPs
- da oligonucleotidos fluorescentes
next generation sequencing
- permite secuenciación de múltiples sitios a escala masiva
- millones-billones de fragmentos de DNA secuenciados en una sola reacción
- cobertura y profundidad
cobertura en el Next Generation Sequencing
promedio de numero de lecturas que se alinean a una secuencia de referencia
profundidad en el Next Generation Sequencing
número de veces que ha sido secuenciado una base del genoma
preparación de muestras para la secuenciación
- fragmentacion
- librerias
- secuenciacion
- analisis bioinformatico
fragmentacion en secuenciación
se cortan segmentos pequeños (100-300bp) por medio de métodos mecánicos (sonicacion) o métodos enzimáticos
son ligados con un adaptador especializado
fragmentos que se obtienen en la fragmentacion par la secuenciacion
qué son las librerías?
segmentos de DNA modificados se adicionan insertos para cada muestra pueda ser identificada
permite la secuencia de multiples muestras
códigos de barra de los segmentos de DNA en librerías
tipos de secuenciadores
- ILUMINA
- ION TORRENT
ILUMINA
flow cells y PCR en puente
ION TORRENT
chips y PCR de emulsión
PCR en emulsión
- en un solo tubo
- perlas de emulsión
- el ciclo de PCR conduce a la amplificación en cada gota
- adaptadores ligados a los fragmentos de DNA de las librerías
PCR en puente
- fragmentos se unen a oligos complementarios
- adaptadores fijos
- la hebra reversa se genera via PCR
- la hebra reversa se curva y se une al oligo complementario para iniciar PCR
- hebra dextrogira se completa y ambas cadenas se desnaturalizan
- se repite el proceso
es la preparacion d emuestras para la secuenciacion
analisis bioinformatico
tipos de analisis
- DNA genoma completo
- RNA-RNA seq
- Exoma completo
- secuencia de panel de genes
base calling en el analisis bioinformatico
identificacion de nucleotidos
read allingment en el analisis bioinformatico
lectura del alineamiento
La secuencia obtenida es alineada con una secuencia de referencia para…
identificar variantes o mutaciones
pasos del analissis bioinformatico
- base calling
- read allingment
- variant identification
- variant anotation
- identificacion de variantes o mutaciones
DNA genoma completo
- deteccion de variantes nuevas
- dificultad en el analisis y resultados
- mayor costo
RNA-RNA seq
- transcriptoma
- mRNA, rRNA, tRNA, microRNA, noncodingRNA
secuencia de panel de genes
- numero especifico de genes relacionados con la enfermedad o grupo de enfermedades
- se recomienda cuando hay un fenotipo caracteristico
- menor costo
qué se evalua en el proceso de validación de corrida?
- sensibilidad analitica
- limite de deteccion
- especificidad analitica
- acurracy
- precision
- cobertura y profundidad
