Secuenciación Flashcards
Secuenciación
Orden exacto de los nucleótidos
dNTPs
nucleótidos no terminadores
ddNTPs
nucleótidos terminadores
Sin OH en 3’ de ribosa
¿Que determinan los ddNTPs?
La variación de longitud de la secuencia
Modelo de SANGER
Método de secuenciación
Se realiza en tubos diferentes
Mezcla del PCR
ddNTPs
dNTPs
Enzimas
MgCl
Visualización de el gel
La secuencia más corta será la primera (hasta abajo) y las ultimas seran las mas largas
¿Para que se utiliza la fluorescencia?
Para identificar las bases de los terminadores
¿Como se excita el fluorocromo?
Con rayos UV
Función de los oligos
Flanquean fragmentos (de donde a donde)
Next generation sequencia
Secuenciación de múltiples sitios del genoma en escala masiva en un sola reacción
Cobertura
Promedio de número de lecturas que se alinean (secuencia de referencia)
Profundidad
Número de veces que ha sido secuenciado una base del genoma
Métodos de fragmentación
Mecánico (sonicación)
Enzimas de restricción
¿Cómo se ligan los fragmentos?
Con adaptadores personalizados
¿Qué es librería?
La adición de insertos para identificación de muestra
¿Que permite la librería?
Secuenciación de múltiples muestras
Función de los secuenciadores
Amplificación simultánea de múltiples fragmentos de DNA
Tipos de secuenciadores
Illumina (PCR en puente)
ION TORRENT (PCR de emulsión)
PCR en emulsión
Adaptadores se ligan a los extremos
Adaptadores
Permiten unión a perlas
PCR en puente
Se unen a oligos complementarios en la celda de flujo
Análisis bioinformático
Identificación de nucleótidos
Lectura de alineamiento
Identificación de variantes en bases
Requerimientos para el proceso de validación
7
1 Sensibilidad analitica
Parámetro del porcentaje de muestras positivas
2 Límite de detección
Refleja la menor frecuencia de una variante
3 Especificidad analitica
Detecta los controles negativos como negativos
4 Exactitud
Concordancia de las mutaciones detectadas y las esperadas
5 Precisión
Refleja la reproducibilidad de los datos
6 Cobertura
Promedio de número de lecturas que se alinean (secuencia de referencia)
7 Profundidad
Promedio y mínima (la necesario para obtener datos confiables)
DNA genoma completo
Detección de variantes nuevas
Para genomas no analizados
Transcriptoma
RNAseq
RNAm
Información genética transcrita en forma de codones
RNAt
Cada AA tiene su RNAt
Descifra los codones
RNAr
Forma ribosomas
Cataliza la cadena de polipéptidos
pre-tRNA
75-80 nucleótidos
Maduracion de pre-tRNA
Se modifican distintas bases
Eliminación de intrones
por splicing (14 nt)
¿Que elimina ribonucleasa P)
Secuencia 5’ (16 nucleótidos)
Residuo UU en 3’
Se reemplaza por ACC para la sintesis de proteinas
Selección de panel de genes
Secuencia número específico de genes relacionados con la enfermedad
¿Cuándo se recomienda la Selección de panel de genes?
Cuando hay un fenotipo característico
Aplicaciones de las secuenciaciones
Diagnóstico
Tratamiento
Aplicaciones en pacientes con cáncer
Analisis de multiples variantes
Utiliza menos tejido
Identifica evolución clonal
Revela heterogeneidad de clones tumorales (seguimiento)
Heterogeneidad genética, dif. genes me dan una misma enfermedad
Microarreglos
Evalúan polimorfismos
Objetivos del proyecto del genoma humano
6
Objetivo 1
Clasificar los genes del genoma humano
Objetivo 2
Determina la secuencia de los nucleótidos
Objetivo 3
Organiza y almacena la información en la base de datos
Objetivo 4
Desarrollar tecnologías para secuenciar de manera rapido
Objetivo 5
Desarrolla herramientas para analizar
Objetivo 6
Establecen leyes que regulen la ética
Porcentaje de genoma repetido en humano
50%
Librerías en HPG
Aislamiento con BAC (cromosomas artificiales bacterianos)
Ensamblaje
Unión de los fragmentos superpuestos
